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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一种由PRRS病毒(PRRS virus,PRRSV)引起的猪病毒性传染病,主要临床特征为妊娠母猪繁殖障碍和各年龄阶段猪呼吸系统疾病。国内于1996年首次分离到PRRSV,2006年由PRRSV变异株引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合症(HP-PRRS)给我国养猪业造成了巨大的经济损失,已成为严重危害我国养猪业的传染病之一。目前,疫苗免疫仍是防控PRRS的有效方法,但现有的经典和高致病性PRRSV疫苗在诱导机体免疫反应和交叉保护等方面存在差异,而关于这种差异产生的分子基础尚无报道。因此,本实验选择经典和高致病PRRSV疫苗株为研究对象,以期通过构建嵌合病毒揭示PRRSV疫苗株产生这种免疫学反应差异的原因或基因区域,同时为PRRSV基因组结构与功能的研究提供新方法和思路。本实验在HP-PRRSV HuN4-F112疫苗株的全长cDNA分子感染性克隆pHuN4-F112基础上,利用反向遗传操作技术,将pHuN4-F112基因序列分别替换为经典PRRSV CH-1R疫苗株的相应基因,最终构建CH-1R株的全长cDNA分子感染性克隆,并将CH-1R基因组第454位的C沉默突变为T产生1个SpeI酶切位点作为鉴定拯救病毒的分子标记。将含CH-1R株基因组全长cDNA质粒线性化后体外转录合成病毒RNA,转染BHK-21细胞包装病毒粒子,24 h后将细胞液上清接种MARC-145细胞,拯救出病毒。通过细胞病变(CPE)观察、间接免疫荧光(IFA)和检测分子标记证明病毒拯救成功。进一步比较拯救病毒与亲本病毒的病毒滴度、增殖动力学曲线,发现两者的病毒学及生物学特性没有显著差异,以上结果表明PRRSV CH-1R疫苗株感染性克隆构建成功。本实验以经典PRRSV疫苗株CH-1R的全长感染性克隆pCH-1R为骨架,利用反向遗传操作技术分别将其ORF1a、ORF1b和ORF2-7替换为HP-PRRSV HuN4-F112的相应片段,构建3个全长cDNA嵌合质粒。将构建的3个重组cDNA质粒经体外转录后转染BHK-21细胞,并于MARC-145细胞中传代,拯救出嵌合病毒,分别命名为rCH-1R-T1a、rCH-1R-T1b和rCH-1R-T27。病毒一步生长曲线结果表明,3种嵌合病毒在MARC-145细胞中的生长特性与亲本病毒rCH-1R基本一致;嵌合病毒接种PRRSV阴性仔猪结果显示,嵌合病毒试验组血清中PRRSV N蛋白抗体阳转率分别为3/3(rCH-1R-T1a)、2/3(rCH-1R-T1b)和1/3(rCH-1R-T27),而rCH-1R免疫组血清N蛋白抗体检测始终为阴性。以上结果表明,PRRSV ORF1a和ORF1b区域在病毒诱导N蛋白抗体产生中起关键作用。