研究背景与目的心力衰竭是指由于心脏的收缩或/和舒张功能发生障碍,心脏不能泵出足够的血液或者通过代偿性地提高心室的充盈压来满足机体正常代谢的需要而引起的一组综合征,是各种心血管疾病的终末期阶段,其具有较高的住院率和死亡率1。根据部位可以分为左心衰竭、右心衰竭和全心衰竭。其临床表现也是不同的,左心衰竭主要表现为肺淤血如咳嗽、咳痰和呼吸困难和体循环灌流不足表现如乏力、头晕和少尿等。右心衰竭主要表现为体循环的淤血如恶心呕吐、下肢水肿,肝脏肿大和肝颈静脉回流等。目前的治疗措施主要包括利尿剂和使用正性肌力药物提高心脏收缩能力来改善心衰症状;神经内分泌系统抑制剂包括肾素血管紧张素-醛固酮系统抑制剂和β受体阻滞剂,这两者能明显改善心脏重构,提高患者生存率和改善患者预后2。但目前即使经过系统的治疗,患者5年存活率仍然不是很高,仍然是心血管疾病致死和心脏抑制的主要原因。心力衰竭的病因是多样的,包括心脏前后负荷的增加（高血压,肺动脉高压,瓣膜关闭不全或狭窄,甲状腺功能亢进等）和原发性心肌损害（心肌缺血/梗死、心肌病,心肌炎症反应和自身免疫性疾病等）3,4。系统和全面地了解和认识心力衰竭的病因和分子发病机制,有助于寻找更好的药物治疗靶点。心肌病是由心肌病变而导致的一组心肌疾病,主要影响心脏的收缩和舒张功能。世界卫生组织将心肌病分为肥厚性心肌病、扩张型心肌病、限制型心肌病、致右室心律失常型心肌病和未分类的心肌病5。扩张型心肌病是最常见的一种异质性心肌病,发病率达到1/400,是心力衰竭的重要原因之一5,6。其特征为左心室射血分数低于45%或短轴缩短率低于25%并且伴有左心室内径大于117%,主要表现为心肌收缩能力的下降7。扩张型心肌病的病因多样,大致包含基因突变8、病毒感染9、酒精滥用、自身免疫系统紊乱和线粒体相关疾病等。目前研究表明某些基因突变如TTN、BAG3和MHY7等会导致扩张型心肌病的发生10。柯萨奇病毒感染是最常见的病毒致病因子,它能通过不同机制导致扩张型心肌病的发生11。虽然不同病因的致病机制还有待于深入研究,但是这一系列因素及其导致的病理生理变化可能影响心肌细胞的钙稳态和ATP能量的代谢。目前对于扩张型心肌病的治疗措施主要是改善心衰时的血流动力学异常变化（包括利尿剂）和抑制过度激活的神经体液机制（如肾素血管紧张素系统阻断剂和β受体阻滞剂等）9。最新研究表明对于提高心肌细胞能量的产生和增强心肌细胞的收缩能力,以及发挥内源性心血管系统保护因子也是治疗扩张型心肌病的主要措施之一12。人类基因组中只有2%左右的基因具有编码蛋白质的功能,其余基因转录产物不具有编码蛋白质或多肽的功能,过去认为是不具有生物学功能的。这些不具有编码功能的转录产物被称为非编码RNA（non-coding RNAs）。Non-coding RNA是一类不具有编码蛋白质功能的RNA分子,根据其序列长短主要可以分为micro RNA（<200nt）和长链非编码RNA（lnc RNA）（>200nt）13。Micro RNA是一类单链小分子RNA,长度大约为22nt左右,通过其种子序列与靶m RNA特异性结合在转录后水平负向调节靶基因的表达14。已有多种micro RNA如miR-1,miR-133a,miR-208a,miR-499被报道在心力衰竭中起重要作用15-17。Lnc RNA是新发现的一类长链非编码RNA,长度大于200nt13。Lnc RNA的作用机制较复杂,定位于细胞核的lnc RNA可以通过改变染色质的结构,结合转录因子或抑制因子和作为增强子起到顺式或反式调控的作用;定位于细胞浆的lnc RNA主要通过结合m RNA或蛋白质调控其稳定性,改变蛋白分子的亚细胞的定位,吸附miRNA等方式起作用18-20。研究表明lnc RNA在高血压,冠心病,心肌肥厚以及心力衰竭的发生发展中起到重要作用,如CHRF,CHAST等21,22。然而,非编码RNA在扩张型心肌病引起的心力衰竭中的表达和生物学作用还很少报道,本研究旨在探讨两个独立的非编码RNA（miR-217和CHKB-DT）各自在扩张型心肌病中的作用与机制,为扩张型心肌病和心力衰竭的诊断与防治提供新的思路。研究方法与结果1.CHKB-DT在扩张型心肌病患者的心脏组织中表达量降低;miR-217在扩张型心肌病患者的心脏组织中表达水平升高。我们通过芯片技术发现一系列差异性表达的miRNA和lnc RNA。其中,CHKB-DT在扩张型心肌病患者的心脏组织中表达降低;miR-217在扩张型心肌病患者的心脏组织中表达水平升高。并且通过实时定量PCR在另一组扩张型心肌病患者和正常对照人群中CHKB-DT和miR-217的表达量得到进一步的验证。2.下调CHKB-DT促进心室扩张和心力衰竭。正常情况下通过应用心脏血清型特异性的重组腺相关病毒以及在心肌细胞特异性启动子的作用下在小鼠心脏组织中抑制CHKB-DT的表达,应用超声心动图检测发现下调CHKB-DT促进左室的扩张而对心室壁的厚度和心功能没有明显的影响。接着应用主动脉缩窄术和重组腺相关病毒技术,在小鼠体内研究进一步研究CHKB-DT的功能作用。通过免疫组化染色、心脏超声和血流动力学检测,我们发现下调CHKB-DT加重了压力负荷下诱导心室的扩张和心脏功能障碍。同时高表达CHKB-DT能够逆转主动脉缩窄术诱导的CHKB-DT的下降,促进压力后负荷诱导的心肌肥厚和改善心脏的收缩功能。3.CHKB-DT结合蛋白EEF1A1,并且抑制EEF1A1蛋白的降解。通过应用RAP,RNA pull down,RNA-FISH,CO-IP和Western Blot等分子生物学技术进行研究我们发现,在人和小鼠内CHKB-DT能够通过其3’端600bp的序列结合EEF1A1蛋白。抑制CHKB-DT的表达能够减低EEF1A1的表达并且进一步促进放线菌酮诱导的EEF1A1降解。CHKB-DT低表达诱导的EEF1A1降解能够被蛋白酶体抑制剂（MG132）所缓解而不能被溶酶体抑制剂所改善。同时,抑制CHKB-DT的表达能够促进泛素分子与EEF1A1的结合。4.回输EEF1A1改善CHKB-DT低表达引起的心室扩张和心功能减低。通过Western Blot,免疫组化染色,心脏超声心动图和血流动力学检测,我们发现EEF1A1在扩张型心肌病患者的心脏组织中表达量下降,低表达EEF1A1同样能够促进压力后负荷（TAC）诱导的心室的扩张和心肌收缩力的下降。抑制CHKB-DT表达的基础上,而挽救实验即心脏组织中回输EEF1A1能够减轻CHKB-DT降低所引起的心室扩张和心脏收缩功能的减低。5.低表达CHKB-DT抑制能量代谢相关蛋白的合成和线粒体的氧化磷酸化水平,减弱心肌细胞的收缩。通过Western Blot和质谱分析等发现,低表达CHKB-DT能够抑制心肌细胞总体蛋白质的表达水平和合成。生物信息学Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）对心脏组织中差异表达的蛋白质分析发现,这些表达降低的蛋白质主要分布于线粒体和细胞膜并且与线粒体和细胞能量代谢相关。并且通过电镜检测发现,低表达CHKB-DT损害线粒体的正常形态。同时,应用线粒体Seahorse实验发现,低表达CHKB-DT降低心肌细胞线粒体的氧化磷酸化水平和心肌细胞的糖酵解途径,减少ATP的生成。应用PET/CT技术在活体内检测心脏的葡萄糖代谢,结果显示抑制CHKB-DT的表达能够抑制心脏组织葡萄糖的摄取。通过分离并检测原代小鼠心肌细胞发现,抑制CHKB-DT的表达能降低原代心肌细胞的收缩能力。6.MiR-217促进心肌肥厚,心肌纤维化和心力衰竭。同样应用主动脉缩窄术（Transverse Aortic Contriction,TAC）建立小鼠心肌肥厚和心力衰竭模型,应用重组腺相关病毒技术在小鼠心脏组织中调控miR-217的表达。通过免疫组化和免疫荧光染色发现,miR-217能够促进心肌细胞肥大和心肌纤维化。心脏超声心动图和左心室米勒导管检测发现,miR-217能够促进心肌肥大和心功能的减低,而抑制miR-217的表达能够缓解TAC诱导的心肌肥厚和心力衰竭的作用。7.MiR-217通过作用于靶点PTEN激活Akt通路。通过生物信息学分析,Argonaute 2免疫共沉淀,蛋白印迹以及荧光素酶报告基因检测,我们发现PTEN是miR-217的下游靶点,miR-217通过下调PTEN的蛋白水平激活Akt通路,从而促进心肌肥厚。PTEN的回输能够逆转miR-217导致的心肌肥厚和心功能下降。8.MiR-217通过外泌体促进心脏组织的纤维化。通过提取外泌体进行实时定量PCR,CCK8等实验分型,我们发现miR-217能通过心肌细胞分泌的外泌体作用于成纤维细胞,并且提高成纤维细胞的增殖活性和促进心脏组织的纤维化。结论在扩张型心肌病心衰患者的心脏组织中,长链非编码RNA CHKB-DT的表达水平降低;而miR-217的表达水平升高。低表达CHKB-DT通过促进靶蛋白EEF1A1的降解进而抑制能量代谢相关蛋白质的合成,降低线粒体的能量代谢从而促进心脏扩张和心力衰竭,而心脏组织中回输EEF1A1能够逆转这一心脏表型的改变。本研究表明长链非编码RNA在心肌能量代谢中具有重要的作用。MiR-217通过抑制靶基因PTEN的表达激活Akt途径从而促进心肌肥厚和心力衰竭,回输PTEN能够改善miR-217诱导的心脏表型,并且miR-217能够通过外泌体作用于心脏成纤维细胞而促进心脏组织纤维化。研究表明非编码RNA可以在细胞间起到调控作用以及在心脏重构中具有重要作用。本研究从非编码RNA的角度,探讨了扩张型心肌病的发病机制,揭示了非编码RNA可以通过调节心肌细胞的能量代谢以及参与心肌细胞与成纤维细胞之间的联系从而调控心脏组织的重构在疾病的发展中起到重要作用,提示可以从改善心肌能量代谢和细胞间联系的角度为扩张型心肌病导致的心力衰竭的治疗提供了理论依据。