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前言支气管哮喘(bronchial asthma,简称哮喘),是由多种炎性细胞特别是巨噬细胞,肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞等参与的慢性气道炎症。国内外支气管哮喘患病率,死亡率逐渐上升,全世界支气管哮喘者约1亿人,成为严重威胁人们健康的主要慢性疾病。我国的哮喘发病率为1%,儿童达3%。神经生长因子(Nerve growth factor, NGF)在炎症反应中起重要作用,被认为是连接神经系统和免疫系统的纽带,许多研究都证明NGF参与哮喘发病,它通过提高气道高反应和诱导气道炎症参与哮喘发病,阻断NGF后可有效减轻哮喘病理变化和降低多种炎性因子的表达。但是NGF参与哮喘发病的机制尚不完全清楚。NGF促进神经细胞分化、发育和营养等生物学作用主要是通过结合其高亲合力特异性受体TrkA (tyrosine kinase receptor A)实现的。此外,神经生长因子介导SH2-Bβ(Src homology 2β)-Akt/PKB (protein kinase B,逆转录病毒Akt8癌基因V-akt编码的蛋白产物,故也称Akt)是调节嗜铬细胞瘤(PC12)细胞的信号途径之一。SH2-Bβ是广泛表达的高度保守的调节蛋白家族成员之一,能结合非酪氨酸激酶2(Janus kinase 2, Jas2)、胰岛素受体酪氨酸激酶和胰岛素样生长因子、NGF、血小板衍生因子、和成纤维细胞因子。SH2-Bp对NGF依赖的轴突生长和轴突存活非常关键。SH2-Bp加强NGF在PC12细胞中Akt的磷酸化和延长Akt酶活性(NGF激活TrkA使其与SH2-B结合,促使SH2-B发生酪氨酸磷酸化之后作用于丝氨酸／苏氨酸激酶Akt／PKB,Akt进一步激活分叉头转录因子(Forkhead transcription factors),促使PC12细胞分化增殖。研究表明SH2-Bβ在哮喘豚鼠肺组织巨噬细胞中过表达,同时还证明它参与NGF与其受体TrkA介导的哮喘发病。这些研究表明SH2-Bp在NGF介导的细胞功能中发挥基础性作用。基于以上信息,我们推测SH2-Bβ调节Akt磷酸化可能参与NGF介导的哮喘发病。本课题利用哮喘小鼠模型,以肺组织为研究对象,观察Akt在哮喘肺组织及炎性细胞中的表达情况,观察NGF和SH2-Bβ与气道高反应的关系,观察阻断NGF和SH2-Bβ肺组织病理变化和炎性细胞数量的变化,应用多种方法观察NGF和SH2-Bβ在哮喘发病机制中对Akt及其活性的影响。为探讨NGF介导的哮喘的可能的发病机制和寻找过敏性气道疾病新的治疗靶点提供理论依据。材料和方法一、主要试剂卵清蛋白(OVA, sigma,美国)；乙酰甲胆碱(mAch, sigma,美国)；RPMI1640培养基(GIBCO);定点突变试剂盒(Stratagene,美国)；兔抗鼠NGF抗体(Sigma,美国)；定点突变试剂盒(Stratagene,美国)；鼠多克隆p-Akt抗体(CellSignaling,美国),辣根过氧化酶免疫组化试剂盒(SABC,博士德,中国);ECL (enhanced chemi luminescence)试剂盒(Sigma Chemical,美国);Trizol裂解液(Santa Cruz,美国)；RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 (Takara Biotechnology,中国大连);RNAout (Takara Biotechnology,中国)。二、主要仪器电子天平(BS110S, Startorius,德国)；恒温冷冻切片机(Leice,德国)；-80℃深低温冰箱(Toshiba,日本);低温冷冻超速离心机(3K18, Hitachi, Japan);超声粉碎机(Dr. Hielscher,德国)；通用电泳仪(Bio-Rad,美国)；普通光学显微镜(COIC, XSZ-H);超纯水系统(Millipore A10):MILLIPOREMILLI-B(美国)；超声雾化器(JWC-201D型,北京超声仪器厂)；AniRes2005动物肺功能分析系统(北京贝兰博科技有限公司)；MetaMorph显微图像分析系统(UIC/OLYMPUS); GDS8000凝胶图像处理系统；PCR仪(Biometra,德国)；Motic Images Advanced 3.2 (Motic, Xiamen)。三、实验方法1、动物及分组雌性BALB／c小鼠85只,6-8周龄,体重20.0-22.0 g,清洁级,购自中国科学院实验动物繁育中心。随机分为4组：正常对照组,OVA组(哮喘组),R555E组,NGF阻断组。2、哮喘模型复制及给药方法1 mg OVA (Sigma, St Louis, MO, USA)和100mg氢氧化铝溶于0.5 ml PBS中,分别于0,7,14和21天腹腔注射给OVA组,R555E组和anti-NGF组小鼠致敏,从22天到30天雾化吸入10 mg／ml OVA PBS激发哮喘,每天一次,每次30分钟。OVA组继续雾化激发三天,而R555E组和anti-NGF组分别在激发前3小时尾静脉注射以1：10稀释于PBS中的50μl多克隆抗体兔抗鼠R555E和NGF,连续三天。正常组以等量的PBS腹腔注射和雾化吸入。3、气道反应性测定采用梯度浓度的mAch激发气道高反应,AniRes2005动物肺功能分析系统进行分析。测定小鼠气道阻力。4、组织切片的准备以上各组动物用多聚甲醛固定,取肺,相同位置切片。5、免疫组织化学方法测定肺组织Akt表达。6、肺泡灌洗液(BAIF)细胞计数及分类计数。用细胞计数板计数细胞总数,涂片进行Wright Giemsa染色作细胞分类计数。7、免疫荧光测定p-Akt表达情况。8、Western blot测定p-Akt蛋白水平,图像分析及数据处理。9、RT-PCR检测Akt mRNA表达,图像分析及数据处理。10、苏木素伊红(HE)染色观察肺组织病理变化。常规包埋,冰冻切片,进行苏木素伊红(HE)染色,观察肺组织病理变化。11、统计学处理所有数据采用SPSS14.0软件分析,实验数据以x±s表示。P<0.05为差异有显著性。1、呼吸频率计数呼吸频率各组无明显差异(P>0.05)。2、支气管和肺组织病理变化炎症细胞,粘膜水肿和上皮损伤anti-NGF组和R555E组小鼠没有未加干预的哮喘鼠明显(P<0.01)。在哮喘肺组织肺泡和支气管周围发现许多炎性细胞包括单核细胞,巨噬细胞,淋巴细胞和嗜酸性粒细胞。而正常鼠肺组织没有上述变化。3、BALF细胞计数和分类炎症细胞,粘膜水肿和上皮损伤anti-NGF组和R555E组小鼠没有未加干预的哮喘鼠明显(P<0.01)。OVA组小鼠的BALF的总细胞数明显高于正常鼠。巨噬细胞,嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数与NGF组和R555E组比较OVA组明显升高。在NGF组和R555E组小鼠肺组织上述变化与OVA组比较明显减轻。4、气道阻力测定哮喘鼠对MCH的气道反应性比正常鼠增强(P<0.01)。静脉注射NGF抗体和R555E的OVA致敏鼠气道反应性明显低于OVA哮喘鼠。5、免疫组织化学染色哮喘组Akt／PKB在各种炎性细胞表达,包括嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞等,并且这些炎性细胞非常多,肺泡内见大量的巨噬细胞,淋巴细胞和浆细胞等。正常组和NGF阻断组炎性细胞表达Akt／PKB很少,并且炎性细胞非常少。6、免疫荧光分析NGF和SH2-Bβ对Akt活性影响肺组织免疫荧光染色显示在OVA组p-Akt水平与正常组比较明显高表达。而上述部位过表达的p-Akt水平在NGF组和R555E组又呈降低趋势。7、免疫印迹法分析p-Akt蛋白表达在正常鼠的肺组织p-Akt蛋白表达处于低水平,而在OVA组则明显升高。NGF组和R555E组由OVA上调的p-Akt水平反而降低。8、Anti-NGF和R555E对Akt mRNA的影响OVA组Akt mRNA水平明显高于正常组,而NGF组和R555E组致敏鼠的Akt mRNA水平与OVA组比较明显降低。结论1、哮喘小鼠气道高反应明显增高,NGF参与哮喘小鼠的气道高反应和肺部炎症反应,阻断NGF明显减轻哮喘小鼠的气道高反应和肺部炎症反应。2、SH2-Bβ参与哮喘气道高反应和肺部炎症反应,阻断SH2-Bβ减轻哮喘小鼠气道高反应和肺部炎症反应。3、Akt信号分子在哮喘时被激活,NGF调节Akt活性可能是NGF参与哮喘发病的机制之一。4、NGF介导的SH2-Bβ/Akt/PKB信号通路可能是NGF参与哮喘发病的通路之一