论文部分内容阅读
支链氨基酸（BCAAs）是调节动物采食的重要氨基酸。目前,关于BCAAs通过中枢神经系统对采食调控的研究已经很广泛,但是BCAAs是否能够通过肠道氨基酸受体感知,调节肠道饱感激素释放,调控仔猪采食,目前尚不明确。在本研究中,我们首先通过对氨基酸感知受体和肠道食欲肽在肠道各肠段的表达进行分析,确定空肠是氨基酸感知受体和肠道食欲肽表达的关键部位。然后,我们建立了空肠组织模型（体外试验）并以此探究了BCAAs介导T1R1和T1R3调控仔猪肠道激素CCK分泌的机制。最后,我们又通过仔猪饲养试验证实了BCAAs缺乏可以通过肠道受体T1R1/T1R3的感知,促进CCK的分泌,并激活GCN2-e IF2α信号通路,抑制仔猪的采食量,最终抑制仔猪的生长性能。主要研究内容和结果如下:体外试验旨在探索BCAAs对仔猪肠道氨基酸感知受体和肠道食欲肽表达的影响。试验首先选取了4头9.0±0.5 kg的断奶仔猪,通过对仔猪肠道各部位氨基酸感知受体和肠道食欲肽在不同肠段的基因表达进行相关性分析,筛选出参与采食调控的潜在激素和受体。随后,采集仔猪近端空肠组织,建立体外试验模型,在RPMI-1640培养基中分别用0、2.5、5、10或15 m M的L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸或BCAAs（Leu:Ile:Val,1:0.51:0.63）混合物处理肠段,以确定合适的处理浓度和时间。最后,分别用丙氨酸、大豆蛋白水解产物、BCAAs和受体抑制剂对空肠组织进行处理,以验证BCAAs通过感知受体调节肠道食欲肽分泌的机制。（1）用10 m M的L-亮氨酸、L-异亮氨酸和BCAAs混合物分别处理仔猪空肠组织2小时,显著增加了T1R1、T1R3的m RNA表达和蛋白丰度（P<0.05）。而10 m M的L-缬氨酸仅增加了T1R1、T1R3的m RNA表达和蛋白丰度（P<0.05）。（2）用T1R1和T1R3抑制剂Lactisole预处理仔猪空肠组织后,发现10 m M的L-亮氨酸、L-异亮氨酸和BCAAs诱导的CCK分泌量显着降低（P<0.05）。此外,T1R1和T1R3的m RNA表达量和蛋白表达丰度的增加幅度也显著降低（P<0.05）。饲养试验旨在验证BCAAs可通过仔猪肠道氨基酸感知受体调节肠道食欲肽的分泌,并激活食欲调节信号通路,最终调控仔猪的采食。试验分为短期饲喂试验和长期饲喂试验两部分,采用了玉米-豆型基础日粮,分为NP组（19.78%,CP）、RP组（17.09%CP,以丙氨酸做等氮对照）、T1组（17.13%CP,BCAAs满足NRC推荐量）和T2组（17.98%CP,BCAAs为NRC需推荐量的1.5倍）。短期饲喂试验选取了24头断奶仔猪,每组分别先饲喂100 g试验日粮,待试验日粮采食完再饲喂普通日粮,统计四个组仔猪的采食量,试验重复三天。长期饲喂试验选取24头断奶仔猪,每组分别饲喂一种试验日粮,试验重复21天。（1）与NP组相比,RP组显著提高了仔猪空肠CCK、PYY、GCG和T1R3的m RNA表达量（P<0.05）;显著降低了空肠中GCG的m RNA表达量（P<0.05）;显著提高了下丘脑中POMC的m RNA表达量（P<0.05）;提高了空肠组织T1R1和T1R3受体蛋白的表达丰度（P<0.05）,以及下丘脑中p-e IF2α和p-GCN2的蛋白表达丰度（P<0.05）;提高了十二指肠和空肠组织中CCK水平（P<0.05）;降低了长期饲喂试验第2周和第3周仔猪的平均日采食量、平均日增重和仔猪末重（P<0.05）;显著增加了耗料增重比（P<0.05）。（2）与RP组相比,T1组显著降低了仔猪十二指肠中CCK、GCG和T1R3的m RNA表达量（P<0.05）,空肠中CCK、PYY、GCG和T1R3的m RNA表达量（P<0.05）;显著降低了空肠组织中T1R1和T1R3受体蛋白的表达丰度（P<0.05）,以及十二指肠和空肠CCK分泌水平（P<0.05）;显著降低了下丘脑中p-e IF2α和p-GCN2蛋白的表达丰度（P<0.05）;提高了长期饲喂试验第2周和第3周仔猪的平均日采食量、平均日增重和仔猪末重（P<0.05）;降低了耗料增重比值（P<0.05）。（3）与T1组相比,T2组显著提高了仔猪十二指肠CCK、PYY和T1R3的m RNA表达量（P<0.05）,空肠CCK、GCG、T1R1和T1R3的m RNA表达量（P<0.05）和下丘脑POMC、Ag RP和NPY的m RNA表达量（P<0.05）;显著提高了空肠受体T1R3蛋白的表达丰度（P<0.05）;提高了血浆中激素PYY的分泌水平（P<0.05）和空肠组织中CCK的分泌水平（P<0.05）;降低了长期饲喂试验第3周的平均日采食量（P<0.05）。综上所述,低蛋白日粮中BCAAs缺乏会抑制仔猪的采食量,其作用机理存在以下两种形式:激活肠道中的氨基酸感知受体T1R1和T1R3,促进肠道中饱感激素CCK的分泌;激活下丘脑GCN2-e IF2α蛋白的磷酸化,促进抑制食欲神经肽POMC的释放。