准噶尔山楂多糖的提取分离、结构表征及生物活性研究

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本文以准噶尔山楂(Crataegus songarica)为原材料,对准噶尔山楂多糖的提取工艺、分离纯化、结构表征及其抗氧化和抑菌活性进行初步研究,为进一步开发和利用准噶尔山楂多糖的药用价值提供一定参考依据。具体研究内容及实验结果如下:(1)利用苯酚-硫酸法测定准噶尔山楂中多糖的含量,并对其含量测定条件进行优化考察。响应面法优化超声辅助法和响应面法优化超声波协同酶法两种多糖提取方法的工艺条件,并以准噶尔山楂多糖得率为主要依据,通过对比确定本实验的最佳提取方法。苯酚-硫酸法测定准噶尔山楂多糖含量的优化条件为:最大吸收波长490 nm、显色时间30 min、浓硫酸用量6.0 m L、苯酚浓度6%、苯酚用量0.4 m L、精密度RSD为0.98%、重复性RSD为1.20%、稳定性RSD为1.15%、加标回收率RSD为1.03%。超声辅助法提取准噶尔山楂多糖的最佳工艺条件为:提取时间为41 min、提取温度为82℃、提取功率为210 W、料液比1:17 g/m L,实际测得多糖得率为5.36%。超声波协同酶法提取准噶尔山楂多糖的最佳工艺条件为:酶添加量为2%、料液比为1:22 g/m L、提取功率为170 W、提取时间为86 min,实际测得多糖得率为8.73%。因此,本实验将选用响应面法优化超声波协同酶法作为准噶尔山楂多糖的最佳提取方法。(2)探究准噶尔山楂多糖的脱蛋白和脱色工艺条件,并对精制准噶尔山楂多糖(SSP)进行分离纯化,对其结构进行初步研究。以多糖蛋白质脱除率和多糖保留率为指标,比较Sevage法和TCA法两种方法的脱蛋白效果。从五种大孔树脂中筛选出适合准噶尔山楂多糖脱色的大孔树脂,以多糖脱色率和多糖保留率为综合指标,利用响应面法优化大孔树脂AB-8的多糖脱色工艺条件,最佳脱色工艺条件为:脱色温度为43℃、树脂用量为8 g、脱色时间为2.0 h,实际综合指标平均值为96.87%。利用DEAE-52离子交换层析柱和Sephadex G-100凝胶柱对精制准噶尔山楂多糖(SSP)进行分离纯化,得到的多糖组分SSP-2a和SSP-3a进行紫外光谱扫描和冻融实验,并对它们的主要化学成分进行分析得到:总糖含量分别为84.91%和81.88%,糖醛酸含量分别为13.59%和10.92%,蛋白质含量分别为0.54%和1.27%。通过高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)、高效液相色谱法(HPLC)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析、刚果红实验、核磁共振(NMR)分析等实验对其结构进行初步分析。SSP-2a和SSP-3a的重分子量分别为8.22×10~4Da、7.71×10~4Da。SSP-2a主要有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖构成;SSP-3a主要有葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖构成。刚果红实验表明SSP-2a和SSP-3a均具有三螺旋结构。通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析和核磁共振(NMR)分析,SSP-2a和SSP-3a符合多糖的特征吸收峰,具有多糖的官能团,它们为吡喃糖。(3)通过对SSP-2a和SSP-3a进行抗氧化和抑菌活性研究。实验结果表明,SSP-2a和SSP-3a的浓度与其抗氧化活性有线性关系,呈正相关。通过SSP-2a和SSP-3a对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性实验,实验结果表明,SSP-2a和SSP-3a均具有抑菌活性,通过抑菌活性实验初筛,SSP-2a的抑菌活性相较于SSP-3a要好,因此选择对SSP-2a进行分浓度的抑菌活性实验。实验结果表明,SSP-2a对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为1.25 mg/mL、5.0mg/mL、0.625 mg/mL。
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