丙烯酰胺(Acrylamide, ACR)是一种常见的化工原料,广泛用于饮水净化、污水处理、造纸、采矿业及科研实验等。人类在20世纪80年代之后已经对丙烯酰胺的毒性有了充分的认识。自从2002年瑞士国家食品监督局首次报道在高温加热食品中发现丙烯酰胺,再一次引起了各国科学家的关注。丙烯酰胺主要通过食源性的非职业途径和职业性接触对人产生毒性作用。此外人体还可能通过吸烟的途径接触丙烯酰胺。丙烯酰胺是一种已知的神经毒性物质和人类的可能致癌物,目前发现除职业接触外,人们还可通过日常饮食(如油炸薯片、薯条、高温烘烤的面包等)摄入大量丙烯酰胺,虽然丙烯酰胺可用被微生物降解,而且由于其具有较高水溶性及低脂溶性,所以不易发生生物聚集,也不易引起生物放大效应。但长期接触丙烯酰胺仍可对生物体产生不良作用：包括影响神经系统,促进癌症的发生,影响生殖和发育等,其危害日益引起人们的重视。丙烯酰胺的神经毒性已经为许多学者所公认,大量的中毒事件也多是围绕其神经毒性方面,但是对雌性动物生殖影响的研究比较匮乏。本实验选用35日龄昆明小鼠饮用丙烯酰胺水溶液,其中一组服用量每天为20mg／kg体重(以下简称20mg组),另一组每天为40mg/kg体重(以下简称40mg组),对照组(以下简称control)饮用自来水。65日龄开始做阴道涂片检查,观察情期规律性。80日龄开始逢发情期(阴道涂片出现团块或成片的角化细胞,可能有极少量的白细胞)处死,采集血清、卵巢、子宫等相关器官。实验过程中分别记录各组小鼠行为和情期变化情况、卵巢、子宫等相关器官的重量极其器官系数,收集一侧卵巢进行组织学处理以观察卵泡发育情况,另一侧卵巢和脑组织测定NOS的水平。主要结果如下：丙烯酰胺对小鼠行为及体重、器官的影响：丙烯酰胺染毒后,小鼠体重随染毒剂量增加增长减慢,实验组小鼠出现神经麻痹和行动障碍。对卵巢观察发现对照组和20mg组小鼠卵巢内出现排卵黄体,40mg组小鼠卵巢细小,无黄体生成,对相关器官称重发现丙烯酰胺主要使卵巢、子宫等生殖器官的脏器系数显著下降(P<0.01).通过观察阴道涂片,并将各段时期所占的比率(情期百分数)进行分析比较,结果发现20mg组发情前期(P)和发情后期(M)的时间极显著高于对照组(P<0.01),而发情期(E)的时间极显著的低于对照组(P<0.01)；另外还发现20mg组小鼠出现间歇发情(发情后直接经过发情后期又再次发情,没有间情期出现)；40mg组的发情前期(P)、发情期(E)、发情后期(M)的时间极显著低于对照组(P<0.01),间情期(D)较对照组显著增大,并且实验后期40mg组小鼠出现长期乏情,阴道涂片检测都为间情期(D)。对各组小鼠卵巢切片HE染色,进行组织形态学观察识别并计出黄体数量,结果发现对照组小鼠卵巢体积都大于实验组,对照组卵巢的黄体数目极显著高于20mg组小鼠(P<0.01)；40mg组小鼠卵巢卵泡多停留在有腔卵泡期,都没有黄体出现。对各组小鼠的血清雌激素和孕激素水平进行检测,结果发现随丙烯酰胺剂量的增加小鼠血清雌激素水平逐渐升高(P>0.05)；而小鼠血清中孕酮水平显著下降(P<0.01)。使用卵巢5%匀浆液,离心取上清测定小鼠卵巢中一氧化氮合酶的水平,结果发现随着染毒剂量的增高卵巢组织中TNOS,及两种分型iNOS和cNOS水平呈升高趋势,实验组与对照组比较存在极显著差异(P<0.01),40mg组与20mg组比较也存在极显著差异(P<0.01)。丙烯酰胺对小鼠脑组织NOS水平的影响：使用脑组织10%匀浆液,离心取上清测定小鼠卵巢中一氧化氮合酶的水平,结果发现,20mg组与对照组比较TNOS水平显著性的下降(P<0.01),而40mg组与对照组和20mg组比较TNOS水平显著性的上升。对两种分型NOS的测定发现,随着染毒剂量的增高脑组织中iNOS水平呈升高趋势,实验组与对照组及两实验组间比较存在极显著差异(P<0.01)；而对cNOS测定发现,实验组与对照组比较cNOS水平都显著性的下降(P<0.01),但是40mg组与20mg组比较cNOS水平却出现升高(P<0.01)。另外发现cNOS的表达与iNOS的表达之间可能存在拮抗关系。以上研究表明丙烯酸胺对雌性动物生殖系统产生毒性作用,影响雌性动物发情、卵泡发育和排卵。丙烯酰胺可能通过影响小鼠脑组织中NOS的分泌,进而影响脑组织特定局部的NO含量,通过下丘脑-垂体-性腺轴对雌性动物生殖机能产生毒性的。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)在氧气存在下能催化精氨酸分解生成一氧化氮(nitric oxide, NO),同时产生L-瓜氨酸。NOS有以下几种形式：神经型NOS(neuronal NOS, nNOS,又称Ⅰ型NOS)、诱导型NOS(inducible NOS, iNOS,又称Ⅱ型NOS)、内皮型NOS(endothelial NOS, eNOS,又称Ⅲ型NOS),其中nNOS和eNOS又被称为组成型NOS (constitutive NOS, cNOS). cNOS为Ca2+依赖型,主要位于内皮细胞(eNOS)及脑(nNOS); iNOS为非Ca2+依赖型,主要位于巨噬细胞、嗜中性白细胞、内皮细胞及上皮细胞。研究已发现多种不同分型的NOS在雌性生殖器官(如卵巢、阴道、输卵管)中有表达,并在生殖生理方面发挥着重要的作用。过去已有关于iNOS和eNOS在卵巢中表达的研究,发现iNOS主要在卵母细胞,颗粒细胞和黄体中表达,而eNOS主要在卵母细胞、颗粒细胞、卵丘细胞和黄体细胞中表达。最近的研究表明在非神经细胞中,如巨噬细胞也有nNOS表达,说明nNOS可能和eNOS、iNOS一样都参与卵巢的生理过程。但至今未见到关于小鼠卵巢中nNOS表达的报道。所以本实验的目的就是研究nNOS在小鼠卵巢中不同卵泡发育阶段的表达与定位情况。免疫组织化学染色结果发现：nNOS在小鼠卵巢的各级卵母细胞细胞质中,次级卵泡、有腔卵泡和闭锁卵泡的颗粒细胞(Gc)的细胞质存在特异性表达,刚排卵形成的黄体(cL)中也有弱表达,而在原始卵泡周围的扁平颗粒细胞、早期柱状颗粒细胞、卵泡膜细胞、血管内皮细胞和卵巢间质细胞中均未检测到表达。这说明nNOS可能在卵泡发育过程中通过调节颗粒细胞的生长和凋亡来调节卵泡的发育。