核酸分子探针是具有广泛用途的一类生化分析工具。典型的核酸分子探针由核酸分子序列和信号报告基团组成,通过碱基互补配对、亲疏水作用、静电吸附等非共价作用实现对目标物的识别,并通过光、电、磁等信号来报告探针与目标物的识别事件。在不同信号模式的核酸分子探针中,光学核酸分子探针因其灵敏度高、检测对象广、检测手段丰富、不需要复杂仪器,甚至仅凭肉眼就可识别等特点,得到了科研工作者的广泛青睐和深入研究。然而一般来说,目标物对核酸分子探针的信号触发是按照1：1的方式进行的,即一个目标物只能够引发一个核酸分子探针的报告信号,这种方式限制了光学核酸分子探针对目标物的检测灵敏度。为此,科研工作者们发展了各式各样的信号放大方法,如核酸工具酶辅助的信号放大技术、基于核酸杂交的信号放大技术、基于纳米材料的信号放大技术、基于荧光共轭聚合物的信号放大技术等。本论文以光学核酸分子探针为工具,以DNA和酶为检测目标,发展了一些新的信号放大技术,具体开展了以下五个方面的工作：1.考察了环氧氯丙烷交联的β-环糊精聚合物对标芘核酸分子探针的荧光增强能力,发展了一种新的信号放大策略,实现了对DNA的检测。标记在核酸分子探针上的芘很容易进入p-环糊精的疏水空腔内,而芘对微环境的改变非常敏感,在疏水环境下发射出强烈的荧光。随着互补序列的加入,探针与互补序列杂交形成双链结构,使标记在碱基上的芘因为空间位阻离开疏水腔体,引起荧光的熄灭。基于这样的原理,本论文构建了一个"turn off的DNA荧光检测方法,线性检测范围为5.0～30 nmol/L,检测限为3.0 nmol/L。为了进一步提高该方法的灵敏度,通过引入核酸外切酶Ⅰ,把标芘核酸分子探针水解为单核苷酸,降低了芘与环糊精腔体主客体识别的空间位阻,提高了芘与β-环糊精聚合物主客体结合能力,使得芘的荧光进一步增强,可将检测限降低到0.9 nmol/L.2.合成了一种新的阳离子p-环糊精聚合物,并基于此聚合物对单标记芘的核酸分子探针的荧光增强作用发展了一种荧光方法用于DNA、腺苷和汞离子的检测。这种阳离子p-环糊精聚合物表面带有氨基,在中性pH水溶液中带正电荷。由于聚合物表面带有正电荷,可以通过静电吸附作用与标记了芘的核酸分子探针结合,有利于芘进入环糊精疏水腔体内,发出强烈的荧光。随着互补序列的加入,核酸分子探针与互补序列杂交形成双链结构,使芘因为空间位阻离开疏水腔体,引起荧光的熄灭。相比于上一个工作,这种核酸分子探针只需要标记一个芘,无需引入酶即可实现对DNA的灵敏检测,线性检测范围为1.25-5.0 nmol/L,检测限为0.3 nmol/L,也表现出良好的选择性,并可用于腺苷和汞离子的检测。3.基于纳米金颗粒比色法和核酸杂交链式放大(HCR)技术发展了一种高灵敏检测DNA的方法。当目标DNA不存在时,两段发夹状辅助探针H1/H2在溶液中可以稳定共存,并且由于发夹探针有一段6 nt的凸出末端能够稳定纳米金颗粒,可以有效避免高盐溶液引起的纳米金颗粒团聚。当目标DNA存在时,目标DNA可以与辅助探针H1/H2杂交引发HCR反应,形成一段双链的长链结构。而这种DNA长链结构因为没有凸出末端,不能起到保护纳米金颗粒的作用,当加入高浓度的盐时,纳米金颗粒就会发生团聚,然后纳米金颗粒溶液颜色就会出现从红到蓝的变化。这个检测方法简便易行,不需要酶的参与,也不需要分离洗脱、化学修饰和昂贵仪器。本工作结合HCR这种无酶的信号放大技术对纳米金颗粒比色法进行了有效的改进,解决了传统纳米金颗粒比色法灵敏度差的缺点,裸眼比色的检测限为100 pmol/L,用紫外可见分光光度计检测的检测限为50 pmol/L,相比于传统纳米金颗粒比色法检测限降低了两个数量级,而且对单碱基突变的DNA链也表现出较好的选择性。4.基于限制性内切酶和滚环扩增技术发展了一种可以对DNA甲基化酶活性进行灵敏检测的荧光方法。当有Dam甲基化酶存在时,发夹探针甲基化酶识别位点上的腺嘌呤被甲基化,同时被限制性内切酶Dpn Ⅰ识别酶切。酶切产物可以作为引物与DNA模板结合触发滚环扩增反应。每个滚环扩增反应的产物都有数千个可以和大量分子信标杂交的重复单元,实现对信号的放大。当没有Dam甲基化酶时,甲基化/酶切反应和滚环扩增放大反应都不会启动,也没有荧光信号的变化。该方法对甲基化酶的线性检测范围为0.5～30 U/mL,检测限可以达到0.18 U/mL。该方法还可以应用于评价甲基化转移酶的抑制剂,有望在药物研发中得到应用。5.基于分子信标发展了一种谷丙转氨酶活性的高灵敏检测方法。谷丙转氨酶能够催化转氨基反应,即将氨基从丙氨酸转移到α-酮戊二酸上。这个转氨基反应的产物为丙酮酸和谷氨酸。在乳酸脱氢酶的作用下丙酮酸又可以被还原为乳酸,同时产生NAD+。只有在NAD+存在下,E.coli连接酶可以将杂交在分子信标环部的两段短链寡核苷酸连接在一起,形成一条完整的长链,并打开分子信标产生荧光。通过测量分子信标的荧光强度可以计算出谷丙转氨酶的活性。该方法对谷丙转氨酶的线性检测范围为0.78～3.13 U/L,检测限为0.25 U/L。