抗生素的过度及不规范使用造成的细菌耐药性已经严重威胁公共健康安全,是目前世界卫生组织密切关注的问题。细菌耐药的主要机理之一是生产金属β-内酰胺酶（Metallo-β-lactamases,MβLs）。因此对MβLs的实时监测与抑制具有极其重要的应用价值。本论文从MβLs活性监测、活性抑制、结构解析等方面进行了以下四部分工作:1、发展了一种简单且无损的UV-Vis方法,用于耐药细菌活菌体内MβLs的实时活性监测与抑制,并通过多种抗生素和临床菌证明该方法的广泛应用性。通过UV-Vis法,测得EDTA和ATAA抑制耐药菌L1-E.coli水解头孢唑啉的IC50值分别为1.6和18.9μM。用UV-Vis实时监测获得的抑制数据更符合其在天然环境中真实的生物学功能。2、通过对ImiS水解亚胺培南的实时监测,发现其水解产物对ImiS具有抑制作用,分离该水解产物获得两个组分P1和P2。动力学评价表明,P1对ImiS、L1、NDM-1和VIM-2呈现广谱抑制活性,其IC50值在8-32μM范围;但P2无抑制活性。同时,P1对产ImiS、L1、NDM-1或VIM-2的E.coli有良好的协同抗菌活性,能够分别恢复亚胺培南和头孢唑林的药效16-32和32-128倍。我们的研究揭示了亚胺培南水解产物对ImiS的抑制是由于P1引起的。该工作为研究抗生素的水解机理及MβLs的抑制提供了新思路。3、为避免天然MβLs中Zn（Ⅱ）离子的抗磁性和无色性影响光谱学表征,使用Co（Ⅱ）离子替代型MβLs进行光谱学研究已经有多年基础,但对apo-MβLs制备过程中EDTA是否除尽却不能确定,对于后续研究结果存在很大影响。我们发展了ITC法监测apo-MβLs制备过程中EDTA的含量。利用Zn（Ⅱ）离子与EDTA和apo-MβLs的反应亲和力不同（优先与EDTA结合）来区分热力学信号,分别对NDM-1、ImiS、L1三个蛋白进行了apo-MβLs制备过程的监测。ITC法能够准确的辨别EDTA是否完全去除。这一方法中样品测量范围广,灵敏度和精确度高等优点,能够为MβLs性质和机理研究提供更准确的热力学信息。4、核磁共振波谱技术作为大分子结构表征技术中唯一能够在原子分辨率下测定溶液中生物大分子三维结构的方法被广泛应用。通过对蛋白进行13C、15N标记的方式来评价其与小分子作用的途径是重要的结构表征手段。这部分工作中表达纯化获得了纯净的13C、15N双标记ImiS和L1。对不同浓度的抑制剂YSK-1a与ImiS作用后HSQC谱图的变化进行对比,确定了YSK-1a与ImiS之间是浓度依赖型的不可逆结合结合。