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肝内胆管癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）是第二大肝脏常见恶性肿瘤,发病率仅次于肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）,占消化道肿瘤的10%,其恶性程度高,预后较差,占全世界癌症死亡率的13%。尽管HCC和ICC都是原发性肝癌,但两者在发病机制以及治疗方式等方面具有很大的差异。ICC预后差的主要原因之一是其发病机制不清楚,早期诊断困难并且缺乏有效的治疗手段。中脑星形胶质细胞源性神经营养因子（Mesencephalic Astrocyte-derived Neurotrophic Factor,MANF）是新型神经营养因子家族的成员之一,内质网应激能上调其表达和分泌。本课题组前期研究发现在HCC癌组织中MANF表达降低,且能通过调节NF-κB/Snail信号通路抑制HCC的发生发展;在ICC中研究发现,MANF的表达与在HCC中相反,提示它在ICC中可能发挥不同的作用。有研究报道MANF表达水平与胆管癌的预后成负相关,敲低MANF能增加化疗药物索拉非尼引起的胆管癌细胞凋亡,提示MANF可能为胆管癌的治疗提供新的策略,但MANF在ICC中的具体作用机制不明。本课题组研究发现MANF与过氧化物酶6（Peroxiredoxins6,PRDX6）有相互作用,且MANF有可能影响PRDX6的表达。PRDX6是过氧化物酶PRDXs蛋白家族成员之一,同时拥有谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GPx）功能和磷脂酶A2（Phospholipase A2,PLA2）活性。PRDX6被发现在肿瘤的发生过程中具有促癌和抑癌的双重作用,MANF与PRDX6在HCC中均表达降低,且发挥抑癌的作用,但两者在ICC中的作用、相互关系及其作用机制尚不清楚。目的研究MANF与PRDX6在ICC中的作用以及作用机制。方法运用免疫组织化学检测74例ICC癌组织以及癌旁组织中MANF的表达情况,免疫荧光检测ICC中表达MANF的细胞种类。分析MANF的表达与其临床病理特征的相关性。运用慢病毒感染、筛选构建稳定敲低MANF的ICC细胞株,Western blot验证敲低效果。然后用MTT法、平板克隆形成、划痕法、Transwell迁移和侵袭实验分别观察敲低MANF对HCCC9810和Hu CCT1细胞增殖、克隆形成、迁移以及侵袭性能力的影响。裸鼠成瘤实验观察Hu CCT1细胞敲低MANF基因后成瘤能力的变化,探讨MANF在ICC发生中的作用。免疫组织化学检测74例ICC癌组织以及癌旁组织中PRDX6的表达情况,免疫荧光检测ICC中表达PRDX6的细胞种类。分析PRDX6与临床病理特征的相关性,以及与MANF表达的关系。硫代乙酰胺（thioacetamide,TAA）诱导ICC大鼠模型观察全敲PRDX6后成瘤情况的变化。敲除组和对照组ICC瘤组织RNA测序,寻找差异基因,研究PRDX6在ICC发生中的作用以及作用机制。基于前期MANF与PRDX6酵母双杂交的结果,在ICC组织中运用免疫荧光检测MANF与PRDX6有无共定位,免疫共沉淀实验了解MANF与PRDX6是否存在相互作用。q PCR和Western blot检测HCCC9810和Hu CCT1细胞敲低MANF对PRDX6表达的影响。进一步检测裸鼠成瘤实验的实验组和对照组ICC组织中MANF和PRDX6的表达情况,研究敲低MANF对PRDX6表达的影响。结果1 MANF在ICC中的表达以及临床意义74例ICC患者肝组织进行免疫组化染色,结果显示在癌组织中MANF蛋白阳性率为93.2%,以中、强阳性为主,癌旁组织MANF蛋白表达阳性率为31.1%,以弱阳性为主,癌组织MANF蛋白表达明显高于癌旁组。免疫荧光发现ICC组织中癌细胞、巨噬细胞表达MANF,肝脏星状细胞则不表达该蛋白。MANF的表达与肿瘤分化程度相关,分化程度低的肿瘤组织MANF表达更高。与肿瘤数量也相关,肿瘤数量≥2的肿瘤组织MANF表达更高。同时MANF在晚期（Ⅲ/Ⅳ）ICC组织中表达明显高于早期（Ⅰ/Ⅱ）。但是MANF表达与年龄、性别及其它因素无关。2 MANF对ICC细胞株恶性生物学行为的影响构建稳定敲低MANF及载体对照组的ICC细胞株。MTT实验结果发现敲低MANF的HCCC9810和Hu CCT1细胞增殖率低于对照组。平板克隆形成实验显示敲低MANF的HCCC9810和Hu CCT1细胞相对于对照组,形成克隆数目明显减少。这些结果提示,敲低MANF后这两种ICC细胞增殖能力降低。划痕实验显示,敲低MANF的两种细胞迁移能力均降低。Transwell迁移实验同样表明HCCC9810和Hu CCT1细胞敲低MANF后迁移能力下降。Transwell侵袭实验结果提示两种细胞敲低MANF后侵袭能力降低。这些结果表明敲低MANF,抑制HCCC9810和Hu CCT1细胞迁移和侵袭能力。裸鼠成瘤实验结果发现,注射敲低MANF的Hu CCT1细胞与载体对照组相比,皮下肿瘤体积小,重量低。免疫组织化学实验发现敲低MANF组的瘤组织Ki67阳性细胞比对照组少。提示敲低MANF能抑制裸鼠体内Hu CCT1细胞增殖,从而抑制肿瘤的生长。3 PRDX6在ICC中的表达以及临床意义免疫组织化学染色发现74例ICC患者癌组织中PRDX6蛋白阳性率为94.6%,以中、强阳性为主,而癌旁组织PRDX6蛋白表达阳性率为38%,以弱阳性为主。PRDX6蛋白表达,癌组织组明显高于癌旁组。免疫荧光发现ICC组织中癌细胞、巨噬细胞表达PRDX6,肝脏星状细胞则不表达。PRDX6的表达与肿瘤分化程度相关,分化程度低的肿瘤组织PRDX6表达更高。与肿瘤数量也相关,肿瘤数量≥2的肿瘤组织PRDX6表达更高。同时PRDX6在晚期（Ⅲ/Ⅳ）ICC组织中表达明显高于早期（Ⅰ/Ⅱ）。而PRDX6表达与年龄、性别以及淋巴转移等因素无关。在ICC组织内,PRDX6与MANF的表达存在相关性,两者的临床意义一致,且表达细胞相同,均在癌细胞与巨噬细胞内有表达,肝星状细胞不表达。4大鼠PRDX6敲除对TAA诱导的ICC形成的影响7-8周野生型（WT）和PRDX6基因敲除(PRDX6-/-)雌性大鼠用300mg/L硫代乙酰胺（thioacetamide,TAA）饮水造模,27周后处死取肝脏组织。统计发现,WT大鼠（n=8）平均肿瘤数（157.143±121.136）,PRDX6-/-大鼠（n=8）平均肿瘤数（30.375±13.773）,PRDX6敲除后,肿瘤数量明显减少。PRDX6-/-大鼠的肝/总体体重比降低,直径≥1cm的肿瘤WT组也多于PRDX6-/-组。两组肝组织取材、切片,免疫组织化学实验表明基因敲除组PRDX6表达较低,两组肿瘤组织胆管型细胞角蛋白CK19阳性。PRDX6-/-组肿瘤组织中Ki67阳性细胞明显减少。HE染色100倍视野下测量切片总面积和肿瘤面积,每个样本取10个视野,取平均值,计算肿瘤面积占肝总面积的百分比。与WT组的（46.169±17.873）相比,PRDX6-/-组的平均肿瘤面积/总面积只有（10.651±8.223）,明显减少。q PCR检测PRDX6-/-组肿瘤组织中Ki67的表达低于正常对照组。以上结果表明,PRDX6敲除抑制肿瘤细胞增殖,ICC肿瘤形成减少。取两组大鼠TAA诱导ICC模型的肝脏肿瘤组织做RNA测序分析,分析PRDX6敲除组和对照组瘤组织差异基因表达。发现敲除PRDX6后有127个基因上调,321个基因下调（n?=3）。两组之间DEGs的KEGG通路分析发现细胞信号转导通路基因变化最大,有47个基因表达发生了改变。WNT信号通路是基因表达变化最多的通路,其中WNT7A、WNT7B、FZD2、Ccnd2和MMP7在敲除PRDX6后表达明显下调。q PCR和免疫组织化学实验验证了这一结果。提示PRDX6可能通过调控WNT7A/B信号通路促进ICC的发生。5 MANF通过与PRDX6相互作用调节其蛋白水平前期课题组酵母双杂交实验发现MANF与PRDX6有相互作用。在ICC组织内,免疫荧光实验表明MANF与PRDX6有共定位,免疫共沉淀实验也证明MANF与PRDX6确实有相互作用。Western blot发现HCCC9810和Hu CCT1细胞敲低MANF后PRDX6蛋白表达降低;q PCR检测发现,敲低MANF不影响PRDX6的m RNA水平的变化。同样检测裸鼠成瘤实验的ICC组织中MANF与PRDX6的表达发现,MANF敲低后PRDX6蛋白表达也降低,m RNA水平没有明显变化。以上结果表明在ICC中,MANF与PRDX6存在相互作用,且敲低MANF,PRDX6的蛋白表达降低。结论1 MANF在ICC癌组织中高表达,并且与肿瘤分化程度、肿瘤数量以及肿瘤分期有关,敲低MANF抑制ICC细胞的增殖、迁移、侵袭和裸鼠移植瘤的生长。2 PRDX6在ICC癌组织中高表达,并且与肿瘤分化程度、肿瘤数量以及肿瘤分期有关,与MANF表达在ICC癌组织中高度相关。敲除PRDX6抑制ICC大鼠模型中肿瘤的形成,可能与调控WNT7A/7B信号通路有关。3 MANF与PRDX6有相互作用,敲低MANF后PRDX6的蛋白表达水平下调,m RNA水平没有明显变化,机制不清。