常用中药吴茱萸为芸香科植物,药理作用主要表现在对于心血管系统和胃肠道的影响以及具有一定的抗肿瘤的作用。吴茱萸碱是吴茱萸中所含的一种色胺吲哚类生物碱,具有调节免疫、抑制脂肪细胞分化、抗炎等作用。有研究发现吴茱萸碱对宫颈癌、前列腺癌和结肠癌多种癌症具有抗肿瘤作用,但其抗肿瘤作用机制尚不清楚。抗血管生成的药物通常可抑制内皮细胞的入侵,通过抑制细胞外调节蛋白激酶的活化,抑制血管内皮生长因子表达。Wnt/β-catenin信号通路与血管的发育和重建关系密切。β-catenin可通过血管生成因子、成纤维生长因子以及E4局部腺病毒等保持自身稳定,促进血管生成反应。血管内皮抑制素发挥抗血管生成作用在某种程度上也是通过诱导β-catenin退化来实现的。本课题在肝癌中对吴茱萸碱抗血管生成与β-catenin信号通路的关联性进行研究。首先在不同整体动物模型、不同肝癌细胞系上验证吴茱萸碱的抗肝癌效应;通过体内和体外实验检测吴茱萸碱的抗血管生成作用;利用Western Blot、Realtime PCR、EMSA等方法在肝癌细胞中探讨β-catenin与血管生成的关联性并观察吴茱萸碱对其影响,从而发现吴茱萸碱的抗肝癌效果及其分子机制,为进一步开发应用吴茱萸碱及寻找肝癌有效的早期生物学标志和抗肿瘤药物提供一定的科学依据。第一部分吴茱萸碱抗肝癌作用的研究目的:探讨吴茱萸碱对裸鼠肝癌移植瘤发生发展及肝癌HepG2和SMMC-7721细胞增殖、细胞周期、凋亡及侵袭转移能力的影响。方法:选取了 H22 ICR小鼠和裸鼠肝癌移植瘤模型、人肝癌SMMC-7721细胞裸鼠皮下移植瘤模型,观察吴茱萸碱对模型动物移植瘤重、瘤体积、抑瘤率、肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)、肿瘤特异性生长因子(TSGF)以及病理组织学的影响;另采用MTT、流式细胞术、细胞划痕试验、transwell小室试验等方法检测吴茱萸碱对肝癌细胞HepG2和SMMC-7721的影响。结果:吴茱萸碱对小鼠或裸鼠H22肝癌移植瘤的抑瘤率可达40%以上;移植瘤生长曲线显示,治疗开始到第5天,吴茱萸组即表现出较模型组生长缓慢,至第14天实验结束,对H22小鼠或裸鼠移植瘤的生长均有明显的抑制作用;吴茱萸碱能显著降低小鼠或裸鼠血清中肿瘤标记物AFP和TSGF的浓度;病理组织学检查提示,吴茱萸碱组小鼠或裸鼠移植瘤坏死程度较模型组明显,以凝固性坏死为主。在人肝癌SMMC-7721细胞裸鼠皮下移植瘤模型中,吴茱萸碱组裸鼠在接种后,瘤体积生长、实验结束所取瘤组织重量均小于模型组,但未见统计学差异;动物瘤组织进行病理组织学检查,吴茱萸碱组肿瘤坏死程度明显高于模型组,提示药物有明显的抗肝癌作用。MTT法检测显示吴茱萸碱对肝癌细胞HepG2和SMMC-7721均有明显的抑制作用,随着浓度的增加抑制率增加。流式细胞术检测吴茱萸碱对人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721细胞周期的影响,结果显示,吴茱萸碱作用于HepG2和SMMC-7721细胞后,G2/M期细胞明显增加。吴茱萸碱20 umol/L对肿瘤细胞的凋亡率可达到40%。划痕实验显示吴茱萸碱能够抑制HepG2和SMMC-7721肝癌细胞的迁移。在显微镜下观察经结晶紫染色后穿透Transwell小室的肝癌细胞数量,吴茱萸组细胞数量明显减少,差异有显著性。结论:吴茱萸碱可抑制小鼠或裸鼠肝癌移植瘤的生长,且通过引起肝癌细胞HepG2和SMMC-7721周期阻滞和细胞凋亡而抑制肝癌细胞生长和侵袭转移能力。第二部分吴茱萸碱对血管生成的影响目的:在细胞、组织和动物水平较系统地探讨吴茱萸碱对血管生成的影响。方法:观察不同吴茱萸碱处理分别对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的血管形成和大鼠主动脉环及经典的基质胶栓形成的影响。结果:吴茱萸碱可明显抑制HUVEC微管生成,已经完全抑制了 HUVEC细胞小管的形成。同时,吴茱萸碱可显著抑制主动脉环在基质胶内形成的微血管样结构。在基质胶栓模型中,吴茱萸碱可明显抑制胶栓中的血管生成,HE染色和基质胶的免疫组化CD31结果均显示,药物可以在体内明显减少VEGF诱导的血管生成,给药组血管数量及血管密度明显减少。结论:吴茱萸碱在细胞、组织和动物水平均可抑制血管生成。第三部分吴茱萸碱抑制β-catenin介导的血管生成目的:探讨吴茱萸碱对肝癌细胞β-catenin和VEGFa分子的影响及其在抑制血管生成和抗肝癌中的作用,阐明吴茱萸碱抗肝癌的部分分子机制。方法:运用免疫组织化学、Western Blot和qRT-PCR等方法观察吴茱萸碱对肝癌H22和SMMC-7721细胞的裸鼠肝癌移植瘤组织及肝癌HepG2细胞β-catenin信号通路及血管生成相关因子的影响。结果:吴茱萸碱组可显著抑制瘤组织中CD31、CD34、VEGFa、VEGFR1、MMP9及β-catenin蛋白的表达水平,且对瘤组织β-catenin mRNA也有一定的抑制。使用不同剂量的吴茱萸碱处理HepG2细胞,发现药物可抑制细胞β-catenin的表达,尤其可明显抑制β-catenin在核中的表达。吴茱萸碱可明显阻滞高表达Frizzled7及β-catenin激动剂LiCl所致肝癌细胞β-catenin和VEGFa表达水平的升高;吴茱萸碱处理后的条件培养液可明显抑制HUVEC细胞微管生成;另采用EMSA实验发现吴茱萸碱可明显减少β-catenin与VEGFa DNA结合量,提示吴茱萸碱在肝癌细胞中可抑制β-catenin的活化,从而抑制VEGFa的转录活性。结论:吴茱萸碱通过抑制β-catenin而降低VEGFa转录活性,从而阻滞血管形成而发挥抗肝癌作用。综上所述,本研究主要发现:1、吴茱萸碱可抑制小鼠或裸鼠肝癌移植瘤的生长,且通过引起肝癌细胞HepG2和SMMC-7721周期阻滞和细胞凋亡而抑制肝癌细胞生长和侵袭转移能力。2、吴茱萸碱在细胞、组织和动物水平上均可抑制血管生成。3、吴茱萸碱可能通过抑制β-catenin而降低VEGFa转录活性,从而阻滞血管形成而发挥抗肝癌作用。