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目的:近年来肿瘤的发病率和死亡率一直呈现持续增高的趋势,其中血管生成(angiogenesis)是肿瘤生长和发展的一个重要促进因素。正常情况下,机体内促血管生成与抑制血管生成因子之间保持一种动态平衡,维持血管系统的正常状态来保持机体各组织器官正常的营养所需。在肿瘤发展过程中,由于各种原因导致肿瘤细胞过度增生,为了满足营养所需,大量的新生血管在瘤体组织中产生,以供给所需的营养物质,促血管生成因子在此过程发挥重要的作用。已有研究表明,抑制肿瘤的血管生成,可以有效抑制肿瘤的生长,发挥一定的抗肿瘤作用。抗肿瘤血管生成已成为肿瘤治疗的新型靶点之一。近期研究表明,Canopy2(CNPY2)是一种新型的分泌型促血管生成因子,具有促进主动脉环新生血管发生和生长的效果。因此,CNPY2可能通过促血管生成作用而参与在肿瘤的发生发展。结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是人类肿瘤的一类高发类型,最新数据显示其发病率和死亡率分别占据肿瘤疾病的第三和第四位。与其他各类型肿瘤相同,目前结肠癌的发病和生长机制仍未明确。课题组在研究中发现结直肠癌患者的癌组织和血浆中,CNPY2水平显著增高,提示CNPY2可能参与结直肠癌生长和发展,但是确切作用和影响尚不清楚。因此,本课题针对结直肠癌,研究了CNPY2在结肠癌生长和发展中的作用研究。通过使用结肠癌HCT116细胞,knockdown细胞CNPY2水平,分别在体外细胞和体内移植瘤中开展CNPY2在结直肠癌生物学活性的作用研究,包括肿瘤的生长、迁移/浸润和凋亡,综合评价CNPY2作为结直肠癌的临床预防或预后评价指标及治疗新靶点的开发应用价值。方法:1.检测临床结直肠癌患者CNPY2表达水平随机选取临床结直肠癌患者,在患者进行手术切除肿瘤的治疗的过程中,收集患者的癌组织和癌旁正常组织(距癌组织>15cm)样品,以及结直肠腺癌患者术前和正常健康人的血浆样品。组织进行RNA、蛋白提取或福尔马林固定制备石蜡包块,分别进行人CNPY2的RT-PCR、Western blotting检测和免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色。通过ELISA法,测定血浆CNPY2蛋白的水平。2.构建稳定转染sh RNA质粒的HCT116细胞系通过sh RNA(short hairpin RNA)knockdown细胞内源性CNPY2基因表达的方式,选择质粒p RFP-C-RS-sh RNA-human CNPY2和p RFP-C-RS-sh RNA-control,采取Lipo2000脂质体转染人结直肠肿瘤细胞116(human colorectal tumor cell116,HCT116细胞)。细胞培养中采取嘌呤霉素(0.5ug/ml)筛选21天,随后有限稀释法进行挑选单个阳性表达质粒的细胞、扩增,获得单细胞克隆。提取细胞RNA、蛋白和培养上清,分别进行RT-PCR、Western blotting和ELISA,检测细胞内源性CNPY2 knockdown的效率。最终成功构建两种稳定转染sh RNA质粒的细胞系:HCT116sh RNA-CNPY2细胞和HCT116sh RNA-control细胞。3.检测CNPY2对HCT116细胞部分生物学活性的影响利用构建的稳定转染细胞系HCT116sh RNA-CNPY2细胞和HCT116sh RNA-control细胞,分别采用CCK8细胞计数法、克隆形成、划痕愈合试验、细胞Annexin V和PI双染流式计数的方法,观察CNPY2在HCT116细胞的生长、迁移和凋亡的作用。4.CNPY2对裸鼠移植瘤生长的影响裸鼠皮下等位注射HCT116sh RNA-CNPY2细胞和HCT116sh RNA-control细胞,观察和记录移植瘤生长情况。21天后,收集移植瘤,测量瘤体大小、重量反映移植瘤生长情况。移植瘤用于制备石蜡包块、切片,分别进行增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、CD105和TUNEL染色,反映CNPY2在瘤体增殖、血管生成和凋亡的影响。结果:1.CNPY2在结直肠癌癌组织水平明显高于癌旁正常组织(p<0.01),并且CNPY2的来源主要是癌细胞分泌的;患者血浆CNPY2水平是正常健康人的1.72倍(p<0.01)。2.成功构建了抑制HCT116细胞细胞内源性CNPY2表达的sh RNA质粒稳定转染细胞系HCT116sh RNA-CNPY2细胞及对照细胞系HCT116sh RNA-control细胞。3.体外knockdown CNPY2后,引起细胞增殖和迁移的减弱,而促进化疗药奥沙利铂诱导的细胞凋亡。4.体内瘤体CNPY2的抑制,降低了移植瘤的生长速度和血管生成情况,增加了瘤体的凋亡。结论:在结直肠癌的癌组织中癌细胞高表达CNPY2,导致癌组织和患者血浆CNPY2水平明显高于正常组织和健康人群,提示CNPY2参与结直肠癌生长和发展。通过HCT116细胞中开展CNPY2作用研究,CNPY2可能通过促进细胞生长、迁移、血管生成和抑制凋亡,在结肠癌的生长和浸润中发挥作用。通过本研究,阐述了CNPY2引起的结直肠癌的生物学改变,为后续与CNPY2有关的结直肠癌发生发展的机制方面研究指出了方向。临床结肠癌患者血浆CNPY2水平的显著增高,提示CNPY2可能是结肠癌治疗新靶点和评价预后的新指标。此外,CNPY2的下调引起奥沙利铂诱导凋亡的增加,对于临床治疗中针对部分耐受化疗药患者的治疗研究是具有重要的参考价值的。