论文部分内容阅读
叶绿素、血红素等四吡咯化合物是植物光合作用和呼吸作用等重要生物学过程的必需分子。5-氨基乙酰丙酸（简写为ALA）是四吡咯化合物合成的共同前体。植物的ALA经由三步酶促反应生成:(1)谷氨酸-tRNA合成酶把底物谷氨酸转移到tRNAGlu上;(2)谷氨酰-tRNA还原酶(GluTR)把底物谷氨酰-tRNAGlu还原成谷氨酸-1-半醛(GSA);(3) GSA氨基变位酶(GSAM)催化GSA异构生成ALA。GluTR是这三步反应中的关键限速酶，也是四吡咯化合物合成的限速酶，受转录水平和翻译后水平的调控。四吡咯化合物合成过程中，多个中间产物的积累会对植物产生伤害，所以，从GluTR这一源头处调控合成途径具有重要的生物学意义。GluTR编码基因HEMA1『的转录受光的调控，在翻译后水平，目前已知的有两个调控因子:合成途径的产物血红素，对GluTR的活性起到反馈抑制作用;定位于类囊体膜的FLU蛋白，是GluTR的负调控因子。2011年发现的GluTR结合蛋白（GluTR-Binding Protein，GluTRBP），可以将一小部分GluTR锚定到类囊体膜，这部分与膜结合的GluTR合成的ALA可以用于血红素的合成，从而满足ALA大量用于叶绿素合成时，植物体对血红素的需求。通过结构生物学的方法，解析GluTR与GluTRBP蛋白、FLU蛋白的复合物晶体结构，探讨GluTR与GluTRBP和FLU的结合方式，对于揭示GluTRBP和FLU对GluTR酶活的调节机制具有重要意义。 通过体外重组的方法，我们将AtGluTR、AtGluTRBP及AtFLU三个蛋白的编码基因ATlG58290(HEMAl)、 AT3G21200、AT3G14110分别构建到大肠杆菌表达载体pMAL-c5x、pET28a(+)和pET22b(+)，转化大肠杆菌表达感受态BL21(DE3)，通过体外表达及纯化获得目的蛋白。GluTR/GluTRBP复合物蛋白通过大肠杆菌共表达，然后体外共纯化的方法获得。得到的纯度高、状态单一的复合物蛋白用于生长晶体，筛选到的蛋白晶体经过优化，通过X射线衍射，得到2.8 A的衍射数据。通过硒代晶体解决了相位问题，最后解析了GluTR/GluTRBP复合物蛋白的晶体结构。通过结构分析可知，GluTR和GluTRBP是以2+2的形式存在，GluTRBP通过其C端DUF2470结构域中的一个螺旋与GluTR的N端催化结构域相互作用。与之前已有报道的甲烷嗜热菌MkGluTR的结构相比，GluTR/GluTRBP复合物中的GluTR处在一种活性状态，NADPH结合结构域向催化结构域有一个大的扭转靠近，因此，两结构域之间缺少一个大的空间，所以，我们猜测该结构是释放tRNAG1u后，依赖于NADPH的还原阶段。GluTR其中一条链的Arg146具有双构象，使得GluTR同SynGSAM一样，两条链是不对称的。通过表面电势图，发现了tRNAGlu可能的结合区域。另外，通过生化实验验证，GluTRBP是一种血红素结合蛋白，对GluTR的活性有促进作用，可能是通过调节产物GSA的释放来调节GluTR的活性。 通过体外表达、分别纯化蛋白、体外孵育的方法，获得GluTR的C端二聚化结构域(GluTRDD)与FLU的TPR结构域(FLUTPR)的复合物蛋白，合作解析了复合物蛋白的结构，明确了FLU与GluTR的C端相互作用。 GluTRBP和FLU分别与GluTR的N端和C端结合，两者的结合部位并不重叠，那么，FLU和GluTRBP会不会与GluTR蛋白同时发生相互作用并发挥调节功能呢？我们在前期工作的基础上，进一步获得了稳定的GluTRBP/GluTR/FLUTPR三元复合物，进行结晶并获得了分辨率为3.2 A的衍射数据，并解析结构，通过结构暗示GluTR可以同时结合GluTRBP和FLU。等温量热滴定实验表明，GluTRBP与GluTR之间的亲和力远大于FLUTPR与GluTR之间的亲和力，暗示GluTR与GluTRBP在叶绿体基质内优先形成稳定的复合物，然后GluTR再通过C端与FLU相互作用。通过以上实验可以推测，GluTR/GluTRBP复合物通过GluTR与FLU的结合被锚定到类囊体膜上。我们没有检测到GluTR与GSAM的结合，推测两者的结合可能需要特定的条件或是一个瞬态过程。