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研究背景与目的:炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一种病因尚不明确的慢性非特异性肠道炎性病变,包括溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s Disease,CD),是胃肠道最为严重的疾病之一。该病常突发起病,多数病程缓慢,有反复发作的倾向,少数病例呈急性暴发,病情凶险,病程较长者亦被认为结肠癌的癌前病变,世界卫生组织将其列为难治性疾病之一。该病在我国发病率比较低,但近年来有大幅增加的趋势。目前认为IBD的发病机制为:环境因素作用于遗传易感者,在肠道菌丛的参与下,启动了肠道免疫及非免疫系统,最终导致免疫反应和炎症过程。但是始终未找到一种特定微生物和IBD恒定相关。Syndecans是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,包含有硫酸乙酰肝素(HS)及硫酸软骨素链修饰的Ⅰ型跨膜核心蛋白。硫酸乙酰肝素链能与许多对血管修复、血管发生及免疫细胞生长及细胞.细胞、细胞-细胞外基质间黏附起调节作用的配体如许多生长因子、细胞因子、趋化因子和细胞外基质等相互作用。Syndecans主要包括四个成员,其中Syndecan-1(CD138)是上皮细胞包括血管内皮细胞的主要Syndecans成员。Syndecan-1携带的HS侧链可结合一系列配体如细胞粘附分子、细胞外基质成份、生长因子及细胞因子等,以共受体方式调节细胞与细胞、细胞与微环境之间的相互作用,参与细胞粘附、组织分化、血管形成及宿主防御等诸多生理病理过程的调节。关于Syndecan-1和肿瘤关系研究比较多,但是在炎症方面却是近几年才开始受到重视,国内罕见报道。Syndecan-1胞外段可在脱落酶(sheddase)作用下从细胞表面水解脱落形成可溶性效应分子并被吸收入血。Syndecan-1的胞外段HS链,是其主要功能部位,能与炎症过程中的众多的粘附分子、细胞外基质成分、细胞因子、趋化因子等结合,在炎细胞的滚动、贴壁、黏附、游出等步骤中发挥作用,因此可认为,Syndecan-1与炎症过程关系密切。在Syndecan-1基因敲除(Sdcl-/-)小鼠中,生长及发育均无异常。但是在绿脓杆菌的攻击下,Sdcl-/-小鼠明显耐受感染,表现出显著下降的细菌定植力及明显减轻的肺部炎症和死亡率,说明Syndecan-1促进了感染性炎症的发生。Syndecan-1还参与细胞-细胞外基质的粘附。介导细胞粘附到胞外基质蛋白的主要受体为整台素家族受体,但胞外基质蛋白还具有结合糖胺聚糖的能力,尤其是硫酸乙酰肝素。细胞能利用整合素和Syndecan-1双受体来介导细胞-细胞外基质的粘附。而在炎症的研究中,国外就肺炎与Syndecan-1的关系研究较多。在肺炎中,已证实MMP-7可导致Syndecan-1的脱落,形成的可溶性Syndecan-1与中性粒细胞趋化因子KC结合,动员KC形成趋化梯度,吸引中性粒细胞,促进肺炎的发生。但是关于Syndecan-1和肠炎之间的关系罕有报道。我们的前期研究发现,Syndecan-1在IBD模型小鼠肠上皮细胞表面的表达明显减低,而血清中游离Syndecan-1明显增加,提示IBD与Syndecan-1脱落增加相关。有研究提示Syndecan-1表达缺失或破坏时可造成肠上皮屏障功能受损,导致蛋白丢失,分泌性腹泻及营养障碍等,而在IBD患者的再生粘膜中也存在Syndecan-1的表达缺失,从而影响黏膜的愈合。另外,Syndecan-1似乎也和各种细胞因子有相互作用。Day RM等证实促炎因子TNF-α,IL-1β对肠上皮细胞中Syndecan-1的表达起下调作用,可能机制为通过使Syndecan-1的外功能区的脱落增加而引起肠道的炎症反应。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性菌细胞壁主要成分,也称为内毒素,在感染和炎症中起着至关重要的作用。鉴于Syndecan-1与炎症及感染关系密切,而肠道非特异性炎症亦和感染有重要关系。基于以上背景,我们推测,肠道细菌可能通过影响Syndecan-1的表达来参与肠道非特异性炎症的过程。因此我们通过与细菌感染密切相关的促炎因素TNF-α和LPS刺激肠上皮细胞,观察不同剂量刺激物对Syndecan-1表达的影响,为Syndecan-1在肠炎发生发展中的作用机制提供重要线索,研究内容包括:1、Syndecan-1在不同疾病患者肠粘膜组织及不同肠上皮细胞系中的表达2、不同剂量TNF-α刺激下Syndecan-1在肠上皮细胞的表达变化3、不同剂量LPS作用下肠上皮细胞及细胞培养上清中Syndecan-1的变化4、不同剂量LPS刺激下肠上皮细胞粘附力的改变。方法1、免疫组化法检测IBD、结肠腺瘤及结肠腺癌患者肠粘膜组织中Syndecan-1的表达。2、流式细胞仪分析不同肠上皮细胞株,筛选出Syndecan-1表达量高的SW480细胞用于后续实验。3、免疫荧光染色法检测不同剂量TNF-α刺激SW480细胞后,Syndecan-1表达变化。4、免疫荧光染色法检测不同剂量LPS作用SW480后Syndecan-1表达变化。5、Dot-blot检测各组细胞和培养上清Syndecan-1蛋白水平的变化。6、细胞计数法检测不同组粘附力改变。7、统计学处理:采用SPSS13.0软件进行统计学分析,数据以(?)±S表示,进行单向方差分析;Dot-blot结果进行多个独立样本的非参数检验;P＜0.05认为差异有统计学意义。结果1、Syndecan-1在肠粘膜组织中的表达:在不同疾病肠粘膜组织中,Syndecan-1表达有明显差异。在IBD患者肠粘膜组织中,上皮细胞表面表达减少,间质表达增多,血清中游离Syndecan-1水平明显升高。而在低分化腺癌中,Syndecan-1表达呈缺失状态。2、Syndecan-1在不同肠上皮细胞的表达:SW480细胞高表达Syndecan-1分子,HT-29细胞表达少量Syndecan-1分子,Lovo细胞基本不表达Syndecan-1分子。3、不同浓度TNF-α作用下SW480细胞表达Syndecan-1的趋势变化:随着TNF-α浓度增加,Syendecan-1的表达荧光强度由强渐弱。TNF-α对Syndecan-1表达呈剂量依赖性。各组间F=73.498,P=0.000,差异有显著性意义。进一步做多重比较对照组(0ng/ml组)和2.5ng/ml组的差别无统计学意义,(P=1.000),而其他的各组间差异均有显著统计学意义(P=0.000)。4、不同浓度LPS作用下SW480表达Syndecan-1的趋势变化:在未加LPS组(即0ng/ml组),可见Syndecan-1膜表达明显,随着浓度增加,荧光减弱,到10~4ng/ml组,荧光几乎不能检测,可见LPS对Syndecan-1表达的影响呈剂量依赖性。各组间F=106.300,P=0.000,差异有显著性意义。进一步做多重比较10~3ng/ml组和10~4ng/ml组的差别无统计学意义,(P=0.066),而其他的各组间差异均有显著统计学意义。0ng/ml组vs10ng/ml组,P=0.003;0ng/ml组vs其他组,P=0.000。5、不同浓度LPS作用下肠上皮细胞Syndecan-1脱落的变化:随LPS浓度增加,细胞培养上清中Syndecan-1蛋白呈逐渐增多趋势,处理组IOD比值高于对照组,各组间差异有显著性意义,χ~2=12.321,v=4,P=0.015。10~4ng/ml组上清中蛋白表达量最高,10~3ng/ml组和10~2ng/ml组次之。6、不同浓度LPS作用后肠上皮细胞同质粘附力改变:随着LPS剂量的递增,细胞与细胞之间粘附力下降。各组间F=264.364,P=0.000,差异有显著性意义,进一步做多重比较。对照组(即未加LPS组)和10ng/ml组的差别无统计学意义,(P=0.984),而与其他的各组差异均有显著统计学意义(P=0.000)结论1、在IBD患者的肠粘膜组织中,Syndecan-1蛋白在膜表达较正常减低,而间质表达增多,血清中游离Syndecan-1较正常对照组明显增多,表明Syndecan-1脱落增加与IBD发生相关。2、促炎因子TNF-α和细菌内毒素LPS对肠上皮细胞Syndecan-1表达呈剂量依赖性,随着TNF-α和LPS浓度增高,肠上皮细胞表面Syndecan-1表达减少,而肠上皮细胞培养上清中游离Syndecan-1逐渐增加,说明细菌感染和促炎因子可促进Syndecan-1的脱落。3、LPS刺激后,肠上皮细胞粘附力亦随之下降,并呈剂量依赖性。4、肠道细菌和炎症因子可能通过增强Syndecan-1的脱落而促进IBD的发生。