论文部分内容阅读
卵巢恶性肿瘤的发病率在女性生殖道恶性肿瘤中居第三位，但死亡率高居妇科恶性肿瘤之首，严重威胁着妇女健康。卵巢癌由于起病隐匿，发现时70%~80%已到中晚期，常伴广泛的盆腹膜种植及大量腹水，手术难以切尽癌肿及阻止腹水生成，因而化疗成为除手术之外的主要治疗手段之一。目前国内仍采用顺铂（DDP）为基础的联合化疗方案作为卵巢上皮性癌的一线化疗方案。但这些化疗对卵巢癌患者的总体生存率并无明显改善，肿瘤组织对以DDP为基础的化疗方案耐药及化疗药物产生的严重副作用是导致化疗失败的最重要原因。因此寻找新的化疗药物，探讨药物作用机制，寻找新的联合用药方法特别是有效、副作用小、价廉、适合中国国情的化疗方案一直是我们共同关注的热点。砷剂是一种古老的药物，我国学者率先将As2O3用于治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）并取得了令人瞩目的成就，开创了恶性肿瘤治疗的新纪元，同时引起了肿瘤研究者对As2O3的极大兴趣。在血液系统肿瘤中砷剂与常规的化疗药物相比其突出的优点在于抗肿瘤作用强、毒副反应低、无骨髓抑制、无交叉耐药等现象发生，但As2O3对实体瘤尤<WP=8>其是卵巢癌的作用目前研究尚少，对其抗癌机制亦不清楚；As2O3和其它抗癌药物联合作用于卵巢癌的研究国内外亦未见报道。因此，本课题通过以下三部分研究，旨在探讨As2O3、DDP单用和合用对卵巢癌细胞生长抑制效应及其对卵巢癌增殖抑制、阻止细胞粘附转移及肿瘤血管生成等抗癌作用可能的分子机制，希望在挖掘祖国传统药物潜力的基础上，探索卵巢癌联合化疗的新途径，为临床治疗卵巢癌提供理论依据。第一部分：目的：体外观察三氧化二砷（As2O3）、顺铂（DDP）对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞增殖的抑制作用及对细胞周期和凋亡的影响。方法：采用MTT法检测不同浓度As2O3、DDP单用或合用对SKOV3细胞的抑制作用，计算合用指数（CI）。采用光镜、透射电镜及流式细胞仪检测As2O3、DDP作用后，SKOV3细胞形态学、细胞周期及其凋亡率的变化。结果：1. As2O3、DDP单用或合用对SKOV3均有抑制作用，且具有浓度和时间依赖性。当药物效应（抑制率）在<85%范围内时，两种药物具有协同作用。72h时As2O3的IC50为4.67μmol/L。2. As2O3、DDP单用或合用36h后，SKOV3均可出现典型的凋亡形态学改变，尚可见到坏死形态学改变。3. As2O3作用24h后，SKOV3细胞同时出现G0/G1及G2/M期阻滞，48h出现 S期及G2/M期阻滞，但以G2/M期阻滞为主，72h则阻滞于G2/M期，且随浓度增加G2/M期阻滞越明显。1.0μmol/L DDP作用24h后，细胞出现G0/G1期阻滞，48h则出现G2/M、S期阻滞，以G2/M期阻滞为主。联合组细胞周期改变与DDP组近似，但各时段阻<WP=9>滞效果更明显。结论：As2O3、DDP单用和合用均能明显抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖、诱导周期阻滞及细胞凋亡。在一定的效应范围内，二者联合具有明显的协同效应。第二部分：目的：体外观察As2O3、DDP单用或合用对SKOV3细胞粘附、转移等生物学行为的影响及相关机制探讨。方法：采用直接计数法检测As2O3、DDP作用于SKOV3细胞48h后对细胞粘附能力的影响，计算相对粘附率。采用免疫细胞化学法观察As2O3、DDP作用48h后，SKOV3细胞CD44v6、E-cad、MMP2表达的改变。结果：1. As2O3、DDP单用或合用均能明显减弱SKOV3细胞的粘附能力，且具有浓度依赖性。联合组作用强于单用药物组。2. As2O3能轻微上调SKOV3细胞E-cad蛋白的表达，降低MMP2表达，明显降低CD44v6蛋白的表达，DDP及联合组也能降低CD44v6及MMP2蛋白的表达，但对E-cad蛋白的表达无影响。结论：As2O3、DDP均能明显减弱SKOV3细胞的粘附能力，其抑制机制与二者下调CD44v6、MMP2表达有关，而As2O3还能同时上调E-cad蛋白表达使癌细胞不易脱落播散。第三部分：目的：从转录及翻译两个水平观察As2O3、DDP对卵巢癌SKOV3细胞VEGF表达的影响，明确As2O3、DDP是否可以通过抑制卵巢癌细胞表达VEGF而达到抗卵巢癌血管生成的作用。方法：1.RT-PCR半定量法测定不同浓度As2O3、DDP作用于SKOV3细胞24h后VEGFmRNA含量的变化；2.用ELISA法测定不同浓度和作用时间下As2O3、DDP对SKOV3细胞培养上清液中VEGF蛋白表达的影响。结果：1.1μmol/L~4<WP=10>μmol/L As2O3能显著抑制VEGFmRNA的表达，且具有浓度依赖性，联合组抑制效果最显著。2. 1μmol/L~4μmol/L As2O3能明显降低培养上清中VEGF蛋白表达，具有浓度依赖性，但随时间延长抑制作用减弱；联合组抑制效果最明显。结论：As2O3能通过降低VEGF mRNA 表达及VEGF蛋白分泌抑制肿瘤血管生成，与DDP联合抑制效果更佳。