【摘 要】
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目的:R-loops是包含RNA/DNA hybrids的转录中间产物,其过度产生引起基因组不稳定和复制应激。Senataxin-associated exonuclease（San1）是一个核酸外切酶,通过与R-loops解旋酶Senataxin（SETX）相互作用保护基因组稳定,San1缺失引起基因组不稳定。哺乳动物心肌细胞（Cardiomyocyte,CM）在出生后7-14天具有增殖潜力,之
【基金项目】
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国家自然科学基金项目的资助（No.81500312）；
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目的:R-loops是包含RNA/DNA hybrids的转录中间产物,其过度产生引起基因组不稳定和复制应激。Senataxin-associated exonuclease（San1）是一个核酸外切酶,通过与R-loops解旋酶Senataxin（SETX）相互作用保护基因组稳定,San1缺失引起基因组不稳定。哺乳动物心肌细胞（Cardiomyocyte,CM）在出生后7-14天具有增殖潜力,之后变成终末分化细胞失去增殖能力,而出生后的富氧微环境引起的ROS介导的DNA损伤是CM退出细胞周期的重要机制。R-loops虽然是导致基因组不稳定性的重要因素,它在心脏中,尤其是在具有增殖能力的新生小鼠心脏中的作用还未被研究过。本研究旨在探究San1缺失对哺乳期心脏发育和成年心脏结构和功能的影响及其机制。方法及结果:首先,我们构建了San1全身敲除小鼠。出生一天的San1-/-小鼠相较于野生型小鼠心重/体重比值明显下降,心肌细胞面积轻微变大。免疫荧光、m RNA和蛋白水平均提示心肌细胞增殖活性下降,RNA测序也显示DNA复制起始通路下调。连续心脏超声发现San1-/-小鼠在出生12周后出现心室壁变薄和心功能下降,切片也显示心脏变小、心肌细胞肥大及纤维化水平提高。RNA测序提示心肌肥厚相关通路上调以及细胞周期相关通路下调。以上结果提示,San1缺失通过引起心肌细胞增殖抑制导致了心脏发育不良。然后,DNA损伤会诱导检查点（checkpoint）激活及细胞周期停滞。为进一步研究San1-/-细胞增殖抑制的机制,我们构建了San1敲除的人源AC16心肌细胞系。通过彗星实验、免疫印迹、流式细胞术以及实时定量等方法发现,San1缺失引起DNA损伤、检查点激活、细胞周期在S/G2期停滞以及增殖抑制。重要的基因修复蛋白（SETX,XRCC1）、增殖蛋白（PCNA,Ki67,Cyclin D1,MCM2-4）表达减少。进一步实验证实,San1缺失引起DNA损伤诱导的PARP1过度激活,导致XRCC1和SETX通过poly（ADP-ribose）-dependent ubiquitination（PARd U）途径过度降解,进一步加重了DNA损伤。以上结果表明,San1缺失通过引起DNA损伤以及S/G2期停滞介导增殖抑制。最后,文献提示San1与SETX相互作用参与DNA interstrand cross-links（ICLs）的修复,SETX是重要的R-loops解旋酶,因此我们进一步探讨San1在R-loops代谢中的作用。免疫荧光、斑点杂交和DRIP-q PCR实验证实San1-/-细胞中R-loops过度聚集。RNase H1特异性降解R-loops,过表达RNH1明显减轻了R-loops在San1-/-细胞核中的聚集,减轻了DNA损伤、PARP1过度激活、检查点激活、S/G2聚集以及抑制的增殖水平。上述结果表明,R-loops过度聚集介导了San1缺失引起的复制应激和基因组不稳定。结论:（1）San1是一个重要的R-loops调控基因,San1缺失引起R-loops聚集,明显破坏了基因组稳定性。（2）San1敲除引起心肌细胞DNA损伤、检查点激活和细胞周期在S/G2停滞,导致心肌细胞增殖减少,并且R-loops聚集是San1缺失引起复制应激和基因组不稳定的主要机制。（3）新生哺乳动物心脏发育期间,过度的R-loops聚集通过引起DNA损伤依赖的细胞周期停滞抑制了增殖期心脏的发育。
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