尽管在过去几十年里卵巢癌的诊疗技术取得了进步,但其发病率和死亡率一直未见明显下降。究其原因,一为卵巢深藏盆腔,早期症状较不典型,出现明显症状时多已发展为晚期;二为卵巢外周无组织结构包被,早期即可出现癌细胞转移;三为尽管卵巢癌晚期患者行肿瘤细胞减灭术并进行以铂类药物为主的化疗可以取得不错的临床效果,但患者的复发率和耐药率较高,长期效果不明显。近年来随着分子生物学的不断发展,人们逐渐的领会到卵巢癌本质上是一种由癌基因的异常激活或者是抑癌基因的异常失活导致的一种多基因疾病。因此,从分子水平探讨影响卵巢癌发生发展的因素是一种治本的策略。Forkhead Box D1(FOXD1)是转录因子叉头框(Forkhead box)超家族的一员,主要参与胚胎时期肾脏和视网膜的发育。近年来的研究显示FOXD1参与了神经胶质瘤、肺癌和乳腺癌的增殖和转移调控。本课题主要探讨FOXD1在浆液性卵巢癌中的作用和机制,目前国内外未见这方面的报道。课题的研究内容主要包括以下4个方面:一、FOXD1在浆液性卵巢癌中的表达及其临床意义二、FOXD1对卵巢癌细胞增殖的影响及其作用机制三、FOXD1对卵巢癌细胞转移的影响及其作用机制四、FOXD1的上游调控机制研究第一部分:FOXD1在浆液性卵巢癌中的表达及其临床意义背景和目的:蒋学锋等人分析了 GEO数据库中3个基因表达谱芯片数据集(GSE14001、GSE15578和GSE12172),结果提示FOXD1在卵巢癌组织中的表达明显低于正常组织。此研究的目的是检测FOXD1在卵巢癌组织中的表达情况及与其与临床预后的关系。材料和方法:首先,我们借助Western blot技术检测了8例卵巢高级别浆液性癌(HGSOC)组织和7例正常输卵管伞端上皮组织中FOXD1的表达情况,然后借助qRT-PCR技术进一步验证FOXD1在20例HGSOC组织和11例正常输卵管伞端上皮中FOXD1的表达情况。随后,我们还运用GSE9891数据集的基因表达谱数据分析了FOXD1在mRNA水平对临床预后的影响。在确定其表达趋势后,运用免疫组化技术检测FOXD1在组织芯片(包含120例HGSOC患者)中的表达情况,并分析其对临床预后的影响。研究结果:Western blot结果显示FOXD1在正常输卵管伞中的表达明显高于HGSOC组织中的表达,qRT-PCR技术结果与Westernblot结果趋势一致。GSE9891数据集中,包含完整临床信息的276名患者生存分析提示,FOXD1表达增高的患者其总生存期和无进展生存期均明显增加;随后单独对152例HGSOC患者的生存分析提示,FOXD1高表达患者的总生存期和无进展生存期均也明显增加。组织芯片免疫组化染色结果显示:在120例HGSOC患者中,FOXD1高表达组的总生存期明显改善。研究结论:FOXD1在HGSOC组织中的表达降低与不良临床预后相关。第二部分:FOXD1对卵巢癌细胞增殖的影响及其作用机制背景和目的:根据以往报告,FOXD1在肺癌、乳腺癌和脑癌中可以影响癌细胞的增殖。根据第一部分的结果,FOXD1在卵巢癌中可能扮演了抑癌基因的角色。此部分研究的目的是观察FOXD1对卵巢癌细胞的增殖能力的影响并探索其背后的相关调节机制。材料和方法:我们借助慢病毒转染方法建立了FOXD1过表达或者敲低的稳定转染细胞系。我们通过克隆形成实验检测FOXD1对卵巢癌细胞增殖能力的影响。为了进一步验证FOXD1对卵巢癌细胞增殖能力的影响,我们还运用裸鼠皮下移植瘤模型来检测FOXD1在体内对卵巢癌细胞生长速度的影响。随后,我们通过流式细胞术确定FOXD1对卵巢癌细胞周期的影响,通过Western blot检测调控细胞周期蛋白的表达与FOXD1表达的关系。然后借助预测转录因子结合位点的网站JASPAR来预测FOXD1与被调控基因启动子的结合位点。在得到潜在的结合位点后借助双荧光素酶报告基因实验逐一验证每个潜在结合位点的活性。此外,我们还借助染色质免疫共沉淀技术进一步验证FOXD1可与靶基因的启动子区域相结合。Rescue实验用来验证FOXD1对卵巢癌细胞增殖的抑制作用主要是通过促进P21实现的。研究结果:细胞实验中,我们发现在FOXD1过表达的细胞株中,卵巢癌细胞的克隆形成能力与对照组相比明显减弱;在FOXD1敲低的细胞株中,卵巢癌细胞的克隆形成能力明显增强。裸鼠体内实验结果显示FOXD1过表达后明显抑制了卵巢癌细胞在小鼠体内的生长。细胞周期分析的结果显示,FOXD1过表达引起卵巢癌细胞周期阻滞于G1期。Western blot结果显示FOXD1的表达与P21的表达在卵巢癌细胞系中存在正相关关系。JASPAR的预测结果显示FOXD1蛋白与P21启动子区存在3个潜在结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果显示有2个位点存在结合活性。随后我们还借助染色质免疫共沉淀技术进一步验证了 FOXD1可与有活性的2个结合位点结合。Rescue实验证实FOXD1主要是通过调节P21来影响卵巢癌细胞的增殖。我们还验证了 FOXD1在P53缺失的H1299细胞中也可以促进P21的表达。研究结论:FOXD1通过靶向促进P21的表达来抑制卵巢细胞的增殖能力,并且这一过程是非P53依赖的。第三部分:FOXD1对卵巢癌细胞转移的影响及其作用机制背景和目的:卵巢癌又被称为沉默杀手,早期无明显症状、患者多难以自我察觉,发现时多已经进展到晚期并出现盆腹腔播散。因此研究影响卵巢癌转移的机制具有重要意义。根据以往的研究,FOXD1在参与了胶质瘤细胞转移能力的调控,但未指出其具体的调节通路。此部分研究的目的就是探索FOXD1对卵巢癌转移能力的影响并探索其背后的分子机制。材料和方法:我们通过划痕实验和Transwell实验检测FOXD1对卵巢癌细胞迁移能力和侵袭能力的影响。借助小鼠腹腔转移瘤模型评估FOXD1对卵巢癌细胞在体内转移能力的影响。随后通过Western blot和qRT-PCR实验检测相关基因的变化情况。然后借助预测转录因子结合位点的网站JASPAR来预测FOXD1与被调控基因启动子的结合位点,随后借助双荧光素酶报告基因实验来验证预测结合位点的转录活性。我们还借助染色质免疫共沉淀技术进一步验证FOXD1可与有活性的结合位点结合。研究结果:在体外实验中,与对照组相比,FOXD1过表达组的侵袭迁移能力明显减弱,FOXD1敲低组的侵袭迁移能力明显增强。体内实验显示FOXD1过表达明显降低了卵巢癌细胞的转移能力。Western blot实验结果显示在FOXD1过表达组中,E-cadherin的表达明显升高,N-cadherin和ZEB2的表达明显降低。在FOXD1敲低组中E-cadherin、N-cadherin和ZEB2的变化趋势正好与FOXD1过表达组相反。JASPAR的预测结果显示FOXD1蛋白与ZEB2的启动子存在4个潜在的结合位点。借助双荧光素酶报告基因实验,我们发现其中一个预测位点具有结合活性。随后我们又借助染色质免疫共沉淀技术进一步证实FOXD1可与这个位点结合。研究结论:FOXD1通过靶向抑制ZEB2的表达来抑制卵巢癌细胞在体内体外的转移能力。第四部分:FOXD1的上游调控机制研究背景和目的:根据以上研究,FOXD1在卵巢癌组织中表达降低且FOXD1低表达与不良预后相关,FOXD1还可以抑制卵巢癌细胞的增殖和转移。据此我们有理由相信FOXD1在卵巢癌中扮演了抑癌基因的作用,但FOXD1在卵巢癌组织中降低的原因未明。因此,我们有必要进一步探索导致FOXD1在卵巢癌组织中表达降低的潜在机制。材料和方法:我们借助m i croRN A靶基因预测数据库TargetS can和rniRanda来预测可能抑制FOXD1表达的miRNA及其结合位点。借助qRT-PCR技术检测miRNA在HGSOC患者组织中的表达水平。随后借助瞬时转染的方法过表达或者敲除miR-30a-5p或miR-200a-5p,借助Western blot和qRT-PCR技术检测转染后FOXD1的表达变化。双荧光素酶报告基因实验被用来检测miR-30a-5p或miR-200a-5p与FOXD1是否存在直接调控关系。研究结果:TargetScan和miRanda的预测结果显示miR-30a-5p或miR-200a-5p均存在与FOXD1 mRNA 3’非翻译区的结合位点。与正常输卵管伞端上皮组织相比,HGSOC患者中miR-30a-5p和miR-200a-5p的表达均明显升高。在转染miR-30a-5p或miR-200a-5p后,FOXD1的表达无论在mRNA水平还是在蛋白水平均出现了明显降低。双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-30a-5p或miR-200a-5p均可与FOXD1 mRNA的3’非翻译区结合并抑制其表达。研究结论:miR-30a-5p或miR-200a-5p均可在卵巢癌细胞中直接抑制FOXD1的表达。