青钱柳中含有多种活性次生代谢产物,已被批准为一种新的食品原料,但由于其繁育困难导致资源匮乏,严重制约了其开发利用。三萜是其中重要的活性成分之一,本实验室利用植物细胞培养技术建立了稳定的青钱柳细胞悬浮培养体系,以之生产三萜酸,采用添加外源诱导子方法以促进三萜的合成,已从信号分子转导途径和MAPK途径初步探索了ANE(黑曲霉诱导子)的诱导作用机制。为了更加深入地探索ANE促进细胞合成三萜的作用机制,本文研究了ANE诱导作用下青钱柳悬浮培养细胞抗氧化相关酶的变化规律,采用Illumina HiSeq 4000测序技术对细胞进行了转录组测序分析,以发掘青钱柳转录水平的生物信息,对ANE诱导下抗氧化系统、调控次生代谢途径的调控因子、JA信号转导途径及三萜代谢途径中的差异表达基因进行了全面的分析,并对关键酶基因CpSS(青钱柳鲨烯合成酶)进行了克隆及生物信息学分析,从基因表达调控的角度探讨了ANE诱导调控青钱柳萜类代谢的分子机制。主要结果和结论如下:(1)ANE诱导作用下青钱柳悬浮培养细胞抗氧化相关酶的活性变化规律:加入ANE诱导10 h左右,细胞三萜含量开始升高,至60 h时达到最高值,含量由12.47μg/mg增至36.46μg/mg,为对照组的3.36倍。ANE诱导作用下,过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和磷脂酶(PLC)这五种抗氧化系统相关酶的活性均发生了明显的时序性变化,各酶的活性均较对照组有明显的提高。SOD的活性分别在诱导1 h、8 h、66 h时出现了3个峰值,POD酶的活性在分别在诱导1 h、8 h、21 h、66 h时出现4个峰值,CAT酶的活性分别在诱导2 h、8 h、24 h、54 h和66 h时出现了5个峰值,PAL酶的活性分别在诱导7 h、18 h和42 h时出现了3个峰值,PLC酶的活性分别在诱导6 h和24 h时出现了峰值。(2)ANE作用下细胞转录组测序与分析:本文采用Illumina HiSeq 4000测序平台分别对青钱柳悬浮细胞对照组(未添加ANE)、ANE诱导20 h和60 h这三个样本进行了转录组测序,获得了67230个高质量Unigene序列,平均长度和N50分别为744 bp和1379 bp;将组装得到的67230个Unigenes通过BlastX与NR、Pfam、String、Swissprot、GO、COG和KEGG七个公共数据库进行序列比对分析,有49.78%的Unigenes比对到公共数据库中;共有7694个Unigenes注释到25个COG功能分类中;共有19398个Unigenes注释到GO功能分类中,获得了128396条GO注释信息。此外,获得了14986个SSR序列,为进一步的遗传学分析提供了丰富的信息。(3)ANE作用下细胞差异表达基因分析:通过对细胞Unigenes的差异表达分析,发现诱导20 h、诱导60 h与CK对照组的DEGs(差异表达基因)分别有24788、24336个;其中与抗氧化系统相关的20个POD、3个SOD和1个CAT候选基因发生了上调;与JA信号转导途径相关的9个JAZ、2个JAR和12个MYC2候选基因发生了差异表达;鉴定出了15990条候选TF(转录因子)基因,其中可能参与调控三萜代谢途径的bHLH、ERF、NAC、C2H2和WRKY等TF家族的差异表达基因较多;鉴定出了75个参与萜类骨架生物合成途径的候选基因及22个参与三萜类生物合成途径的候选基因。此外,采用RT-qPCR检测对与三萜代谢相关的12个表达量上调基因进行验证,结果显示这12个基因表达量上调,与转录组测序数据一致。(4)CpSS全长基因克隆及序列分析:本文根据青钱柳悬浮培养细胞转录组测序信息,注释到了鲨烯合成酶的候选基因;以该基因序列为基础,采用RT-PCR和RACE技术从细胞中克隆出了全长为1667 bp的CpSS基因cDNA序列,该序列包含了一个1245 bp的完整ORF,编码414个氨基酸;CpSS序列与胡桃SS基因的相似度最高,相似度达到了97%,与白桦、葡萄、大豆、甘草、可可等物种的相似度都达85%以上,与胡桃和白桦的亲缘性关系最近。序列分析表明,CpSS蛋白属于不稳定亲水蛋白,具有典型的鲨烯合成酶保守区和结构域,存在于内质网膜中,由多个α螺旋组成空穴状结构,该结构与大多数植物鲨烯合成酶蛋白的空间结构相似。综上所述,青钱柳悬浮培养细胞在ANE诱导作用下,抗氧化相关酶的活性明显提高,通过JA信号转导途径介导,调控三萜合成途径中的转录因子,使其途径中的关键酶基因发生差异表达,从而促进细胞中三萜的合成与积累。