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ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel,K-ATP通道)是一类耦联细胞代谢扣电活动、以细胞内的ATP/ADP水平为门控因素、非电压依赖性的特殊钾离子通道。脑内K-ATP通道的分子组成具有多样性,一般而言神经元的K-ATP通道主要是由Kir6.2亚基构成,Kir6.1亚基则主要构成星形胶质细胞、小胶质细胞、成年神经干细胞和线粒体的K-ATP通道。K-ATP通道亚基组成的差异为研发高选择性治疗药物提供了重要的生物学基础。近年来,包括本实验室在内的研究表明,开放K-ATP通道可以通过抗兴奋性神经毒性、抗神经炎性反应、减少神经元凋亡等多个环节发挥神经保护作用。因此,K-ATP通道是针对中枢神经系统(central nervous system,CNS)疾病的复杂病理机制实施多靶点保护性治疗、研发新型神经保护剂的理想靶标。
随着对CNS疾病发病机制认识的不断深入,近年人们提出神经损伤的治疗应从单纯的调节神经元功能的模式逐步转向以调节神经元-胶质细胞、胶质细胞.胶质细胞相互作用的新模式。已有研究表明神经胶质细胞在多种神经系统疾病的发生发展过程中发挥重要的作用,尤其是星形胶质细胞介导的神经保护/神经损伤双重作用和小胶质细胞介导的神经炎性病理损伤作用更受学术界的高度关注。因此,靶向于胶质细胞功能的调节是治疗CNS疾病引人注目、富有前景的新策略,调节胶质细胞功能已经成为研发新一代神经保护剂的重要靶标。此外,研究显示多种神经退行性疾病及精神类疾病发病过程中均伴有成年神经再生的异常。作用于神经再生的调节因素,促进内源性神经再生,将成为神经系统疾病治疗中促进组织修复和功能重建的新策略。因此,寻找调节成年神经再生的新的内源性靶标、研发有确切促神经再生作用的神经保护剂已成为治疗神经系统疾病的新方向。
目前利用K-ATP通道敲除小鼠研究K-ATP通道与神经保护相关性的报道甚少。鉴于Kir6.2是构成神经元K-ATP通道的主要亚基,本文工作应用Kir6.2基因敲除小鼠研究、阐明K-ATP通道在经典生物毒素MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetraydropyridine,MPTP)急性神经毒性中的作用,旨在获得K-ATP通道发挥神经保护作用的直接证据,并进一步完善其神经保护作用的相关机制,为治疗CNS疾病提供新的思路,也将为研发理想的神经保护剂提供新的靶标。
目的:应用Kir6.2基因敲除小鼠研究、阐明K-ATP通道对MPTP急性神经毒性的调节及其作用机制。
方法:1)预先给予WT以及Kir6.2 KO小鼠Iptakalim(10mg·kg-1·day-1,p.o.)、Diazoxide(10 mg·kg-1.day-1,p.o.)、Cromakalim(150或300 μg·kg-1·day-1,p.o.)灌胃;1h后皮下注射MPTP(20mg·kg-1,single injection,s.c.),同时腹腔注射丙磺舒(probenecid,250 mg·kg-1in DMSO,i.p.)。MPTP注射后连续给予Iptakalim、Diazoxide、Cromakalim灌胃3d;于实验第3d统计死亡率并应用自主行为和爬杆实验观察小鼠行为学改变;同时对部分动物进行5-溴脱氧尿核苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)标记(50mg.kg-1·every2h×4,i.p.),24h后灌注动物取脑;未进行BrdU标记的动物处死后留取纹状体脑区新鲜脑组织。2)应用免疫组织化学研究纹状体及黑质脑区DA能神经元损伤、星形胶质细胞活化情况,同时检测侧脑室室管膜下区(subventricular zone,SVZ)、海马颗粒细胞下区(subgranularZone,SGZ)神经再生的变化;应用高效液相色谱法检测纹状体多巴胺及其代谢产物的含量改变以及氨基酸类神经递质的水平。
结果:1)(Kir6.2基因敲除能显著增加DA(dopamine,DA)能神经元对MPTP神经毒性的敏感性:自主活动和爬杆实验结果显示,KO小鼠在基础状态下即存在着运动协调能力的障碍;单独给予MPTP/丙磺舒后,野生型和基因敲除型小鼠的死亡率分别为4.8%和11.1%,KO小鼠的死亡率为WT小鼠的2.3倍;在KO小鼠中,MPTP可诱导其黑质致密部TH(tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经元以及纹状体TH阳性纤维密度显著减少、纹状体DA水平的显著降低、纹状体和黑质区显著的星形胶质细胞增殖活化、SVZ区和SGZ区的神经再生抑制;而WT小鼠中仅出现纹状体星形胶质细胞的活化增殖以及SGZ区神经干细胞增殖的减少,且MPTP导致的纹状体DA水平的下降幅度小于KO小鼠。2)预先给予K-ATP通道开放剂Iptakalim、Diazoxide以及Cromakalim可发挥神经保护作用:在KO小鼠中,Iptakalim(10mg·kg-1·day-1,p.o.),Cromakalim(300μg·kg-1.day-1,p.o.)可显著对抗MPTP导致的神经毒性,促进黑质区DA能神经元存活(TH阳性细胞数分别恢复至对照组的88.2%和89.1%),并减轻MPTP诱导的黑质脑区和纹状体星形胶质细胞活化增殖以及逆转MPTP抑制SVZ区、SGZ区神经再生的作用。而WT小鼠中,非致死剂量的MPTP/丙磺舒单次注射虽然尚未引起黑质区TH神经元的变性坏死,但可导致纹状体区星形胶质细胞的活化增殖,SGZ区神经干细胞增殖的显著降低;Iptakalim(10mg.kg-1.day-1,p.o.)、Cromakalim(1 50或300μg·kg-1·day-1,p.o.)可以减轻MPTP引起的纹状体星形胶质细胞活化增殖;Iptakalim(10 mg·kg-1.day-1,p.o.),Cromakalim(300 μg·kg-1·day-1,p.o.)以及Diazoxide(10mg·k-1·day-1,p.o.)能够逆转MPTP对SGZ区神经再生的抑制作用,促进新生细胞数量恢复至正常水平。然而,Iptakalim、Diazoxide、Cromakalim均未能改善两种基因型小鼠中MPTP诱导的DA含量的减少。
结论:应用Kir6.2基因敲除小鼠建立MPTP急性神经毒性模型的在体研究显示,Kir6.2基因敲除加重MPTP诱导的神经毒性;K-ATP通道开放剂能够逆转MPTP所致的急性神经损伤。
综上所述,本研究工作的主要创新之处在于:
应用Kir6.2基因敲除小鼠研究、阐明K-ATP通道在MPTP急性神经毒性中的作用,获得K-ATP通道发挥神经保护作用的直接证据;研究结果提示K-ATP通道通过调节胶质细胞功能与成年神经再生发挥神经保护作用。