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口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是一种由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)引起的主要感染偶蹄类动物的传染性疾病,具有发病率高、传染性强等特点,对全球的畜牧业造成了严重的损失。FMDV的衣壳结构含有VP1蛋白,它暴露在病毒颗粒表面,不但是FMDV感染细胞的必需,而且能刺激宿主产生中和抗体。纳米化的纤维素(cellulose nanocrystal,CNP)比表面积大、生物活性良好且无毒,与抗原结合后还可增强抗原的免疫效应。抗原分子与纤维素结合域(cellulose-binding domain,CBD)融合后,可与CNP结合而纳米化。本研究制备了融合CBD的O型口蹄疫VP1抗原,使之结合纳米纤维素,实现了抗原的纳米化,经体内实验证明具有免疫活性。过程如下:1.重组质粒p ET19b-CBD-FMDV-VP1的构建。首先设计和合成寡核苷酸引物,以质粒p UC-sp-CBD-sc Fv为模版,用PCR的方法扩增CBD DNA。PCR产物经酶切和纯化后,取代质粒p ET19b-CBM-VP1中的CBM DNA片段。实验中共获得15个重组子,从中挑选了5个重组子,菌液PCR、酶切分析和DNA序列测定的结果表明目标重组质粒构建成功。2.CBD-FMDV-VP1的原核表达与最佳诱导条件的确定。将重组质粒p ET19b-CBD-FMDV-VP1转化感受态菌株E.coli BL21(DE3),获得工程菌,挑选单克隆后分别进行诱导表达。经SDS-PAGE定性检测,表达产物分子量为58.6KDa,符合预期。经Western blotting检测,工程菌表达产物可与VP1抗体特异性结合。诱导条件包括IPTG的浓度、作用时间和温度的试验结果表明,在37℃条件下用0.4m M的IPTG作用6h为最佳诱导条件。3.CBD-FMDV-VP1的纯化及复性。工程菌表达目的蛋白主要以包涵体的形式存在。首先超声破碎菌体,收集并纯化包涵体。然后将包涵体用变性液溶解后用镍柱亲和层析法对CBD-FMDV-VP1蛋白进行纯化,确定了洗涤缓冲液(Wash Buffer)及洗脱缓冲液(Elution Buffer)的最适咪唑浓度分别为4m M和50m M。纯化后,变性蛋白又进行了复性处理。4.纳米纤维素的制备。本实验采用酸水解法制备。粉末状软木纸浆(93A-A)经64%硫酸在45℃下水解45min,后经透析、超声破碎、滤膜过滤制备出纳米纤维素材料。经激光粒度仪及电子显微镜检测,其长度在100-300nm之间,宽度在10-40nm之间,流动力学平均半径为169nm。5.CBD-FMDV-VP1蛋白与纳米纤维素的结合。将复性后的CBD-FMDV-VP1蛋白溶液与制备好的纳米纤维素晶体悬浮液混合进行结合,形成纳米粒度结合蛋白CBD-FMDV-VP1-CNP,并对结合条件进行优化。经SDS-PAGE实验得知,在4℃下,纳米纤维素与蛋白CBD-FMDV-VP1的比例为10:1(质量比),结合6h后两者的结合效果最佳。Dot blotting实验表明,获得的CBD-FMDV-VP1-CNP可以与VP1鼠源单抗高效特异结合。6.CBD-FMDV-VP1及CBD-FMDV-VP1-CNP的免疫活性研究。选取18只6-8周龄的昆明雄性小鼠,3只为一组分为6组,分别标号为A组、B组、C组,D组、E组及F组。将弗氏完全佐剂乳化的CBD-FMDV-VP1蛋白进行腹腔注射A-E组小鼠,完成第一次免疫。A-E各组小鼠的注射剂量依次为0μg、25μg、50μg、75μg和100μg。将弗氏完全佐剂乳化的CBD-FMDV-VP1-CNP蛋白进行腹腔注射F组小鼠,第一次免疫注射剂量为100μg。在第一次免疫后的第21天,各组小鼠接受第二次免疫,方法同第一次免疫,注射剂量减半。Western blotting实验证明,经CBD-FMDV-VP1及CBD-FMDV-VP1-CNP免疫的小鼠血清中均含有VP1抗体。间接Elisa分析结果显示,第一次洗免疫后的第7-35天,B-E组小鼠血清中均产生VP1的抗体,抗体水平随时间和抗原剂量的增大而升高,其中E组小鼠免疫后28天的抗体效价为1:3200;第一次洗免疫后的第7-35天,F组小鼠血清中产生VP1的抗体,抗体水平随时间延长而升高,免疫后28天后,F组小鼠血清中产生的VP1抗体效价为1:6400。结果表明,CBD-FMDV-VP1-CNP的抗体效价提高了1倍。