论文部分内容阅读
研究背景肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,我国肺癌的死亡率居第一位,严重威胁着我国居民的健康。肺癌的发生和发展是一个多因素、多阶段累积的复杂过程,比如病毒的感染、基因的异常表达、过量摄入酒精等,但具体的分子作用机制研究尚未明确。SOX家族基因作为Wnt/β-catenin信号通路负性调控因子,其异常表达导致Wnt/β-catenin信号通路被异常激活与许多人类肿瘤的发生发展相关,包括胶质瘤、结肠癌、肝癌等。第一章SOX蛋白在肺癌组织和肺癌细胞系中表达水平的检测目的构建肺癌中SOX蛋白表达谱,分析其相关性及其与临床病理相关因素的关系,研究SOX基因异常表达及临床病理因素在肺癌发生发展中发挥的作用。方法1.肺癌细胞系及组织样本6株肝癌细胞系包括A549、NCI-H520、 HTB-56、Calu-6、WCQH-9801。采集240例肺癌患者手术后癌组织及其配对癌旁组织,40例正常肺组织,并收集其临床病理相关资料。采集标本和收集资料前征得患者的知情同意。2.肺癌细胞系及组织中SOX蛋白表达水平的测定应用蛋白质免疫印迹方法测定肺癌细胞系、正常肺组织、肺癌组织及配对癌旁组织中SOX蛋白表达水平,以p-actin作为内参基因。3.数据分析应用SPSS18.0统计软件对数据进行分析,对肺癌细胞系和正常肺肝组织中SOX蛋白表达量进行配对t检验,对肺癌组织和配对癌旁组织SOX蛋白表达量进行Wilcoxon符号秩和检验,以此描述肺癌细胞系和组织中SOX蛋白表达的差异。对肺癌组织和配对癌旁组织中SOX蛋白表达量进行Spearman秩相关分析,以此描述SOX蛋白表达水平的相关性。以α=0.05作为检验水准。结果1.SOX蛋白在肺癌细胞系中的表达水平SOXl,SOX2,SOX7,SOX8和SOX17蛋白在6例肺癌细胞系中的表达均低于其在40例正常肺组织中的平均表达量,且其在6例肺癌细胞系和40例正常肺组织中蛋白表达差异具有统计学意义(t=-3.142,P=0.019;t=-2.864,P=0.031;t=-2.948,P=0.026;t=-3.285, P=0.015:t=-2.941,P=0.028).2.SOX蛋白在肺癌组织及配对癌旁组织中的表达水平在240例肺癌组织中,SOX1低表达率为52.5%,SOX2和SOX7的低表达率达47.5%,而SOX8的低表达率高达55%,且其在240例肺癌组织和配对癌旁组织中的表达差异具有统计学意义(t=-2.886,P=0.005;t=-2.089,P=0.047;t=-2.094,P=0.041;t=-2.309,P=0.023),而SOX3mRNA在108(45%)例中的表达上调,且与240例配对癌旁组织中的表达差异具有统计学意义(t=1.108,P=0.346)。结论1.肺癌中SOX家族基因mRNA表达异常,它们可能通过异常激活Wnt/β-catenin信号通路促进肺癌的发生及发展。2.SOX家族基因之间可能通过复杂的相互作用模式在肺癌发生及发展的过程中发挥重要作用。第二章SOX7在肺癌中的表达及其临床意义目的探讨SOX7在肺癌组织中的表达及其临床意义。方法利用逆转录聚合酶链反应及蛋白印迹技术检测SOX7mRNA和蛋白在肺癌组织中的表达;重亚硫酸盐测序PCR(bisu1fitesequencing PCR, BSP)和结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis, COBRA)检测启动子区域甲基化状态。采用免疫组化SP法检测240肺癌组织及40例肺部良性病变组织中SOX7的表达并采用Image Pro Plus软件测定每张切片的平均积分光密度。结果无论是mRNA水平还是蛋白水平,肺癌组织中SOX7的表达低于癌旁组织;SOX7在淋巴结阳性和阴性组中表达的平均灰度值分别为17.3±4.1和26.3±5.6,二者比较有统计学意义(P<0.05)。对肺癌中SOX7基因甲基化阴性组和阳性组SOX7蛋白表达情况检测发现,甲基化阴性组SOX7表达灰度值为38.9+9.4,而阳性组的灰度值为14.7+7.6,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论基因甲基化导致SOX7表达下调,与非小细胞肺癌淋巴结转移和临床病理分期负相关,SOX7可能对非小细胞肺癌的发生发展且有抑制作用。第三章SOX7基因稳定转染对人肺癌细胞株A549细胞增殖及周期的影晌目的探讨SOX7蛋白对人肺癌细胞株体内外增殖能力的影响。方法SOX7基因脂质体法稳定转染肺癌细胞株A549,筛选出稳定高表达SOX7的克隆,并用实时Rt-PCR和免疫印迹法鉴定。应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞的生长能力,软琼脂克隆生长实验检测细胞锚定非依赖性生长能力,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况,通过整体成像系统观察SOX7对细胞在裸鼠体内成瘤能力及肿瘤生长能力的影响。结果成功构建pcDNA3.1-SOX7表达载体,将其稳定转染至A549细胞中。MTT法检测结果显示,转染后的细胞生长速度明显慢于对照组,软琼脂中克隆生长能力较对照组也明显下降。流式细胞术检测结果显示,高表达SOX7可使细胞阻滞在G1期。裸鼠皮下注射携带GFP的稳定细胞系,整体成像观察过表达SOX7的细胞成瘤能力和肿瘤生长速度均低于对照细胞。结论SOX7基因具有抑制肺癌细胞增殖的能力,可能作为肺癌发生过程中一个有价值的指标。