茶叶是一种天然的饮料,通过改变加工工艺,使物质成分变化,进而改变茶叶的品质。PPO是茶叶加工过程中一种重要的酶,通过杀青、萎凋、发酵等工艺调控茶叶中PPO的活性,决定PPO是否参与到物质的氧化还原反应当中,进而形成不同的茶叶品质。在绿茶加工中,通过酶的热变性来抑制PPO活性,保证绿茶清汤绿叶的品质。红茶加工中,通过萎凋和后期的发酵工艺,充分发挥PPO活性,使PPO催化儿茶素类物质反应形成茶黄素等复杂的化合物,从而形成红茶红汤红叶的特征。然而,在生产中发现,茶黄素的生产效率并不是很高,可能和PPO酶活性的不够稳定以及合成机理的复杂性有关。因此,能够通过找到稳定、单一、活性高的PPO酶源成为目前解决体外合成茶黄素的一个迫切的问题。近年来,不少研究通过体外提取PPO的粗酶来研究酶的活性,但是由于品种、采摘方法、分离方法的不同等原因导致最终得到的PPO的含量、种类有所差异。并且获得酶液均为几种PPO同工酶混合体,分离纯化非常困难,因此不利于研究单一酶源对茶黄素的合成机理的影响。本研究运用qRT-PCR技术探究在不同品种、不同采摘标准、不同胁迫条件下CsPPO基因的转录水平上表达差异性;并且选择两种原核表达载体,并通过构建不同工程菌,以期获得可溶性高、活性高的PPO,主要研究结果如下:(1)利用生物信息学对PPO氨基酸序列进行分析,茶树CsPPO基因共编码599个氨基酸,分子量约为67(kd);经过与其他物种比对,选择第43个氨基酸和第70个氨基酸作为转移肽的位置。(2)运用qRT-PCR技术,检测了茶树CsPPO基因在不同品种、不同采摘标准、不同胁迫条件下的表达。结果表明茶树CsPPO基因在不同茶树品种有表达差异,仅在‘白叶1号’与‘黄金芽’之间、‘福鼎大白’和‘紫鹃’的芽中表达无差异。在不同采摘标准茶树CsPPO基因在‘福鼎大白’茶树品种一芽一叶、一芽二叶的表达量较高,在‘白叶1号’茶树品种一芽一叶、一芽二叶的表达量较低,且在‘白叶1号’、‘黄金芽’的变化趋势相同。对茶树分别进行了高温、干旱、低温、NaCl处理,通过荧光定量检测茶树CsPPO基因在不同胁迫条件下的表达。结果表明,在高温、干旱、低温、NaCl处理中,茶树CsPPO基因的表达量均呈现了差异表达,其中干旱和NaCl处理的变化趋势相同,均呈现先下降再升高的趋势,而干旱和高温的变化趋势相反。(3)以茶树CsPPO基因全长为模板,选择两种原核表达载体,构建四种重组原核表达载体:分别为 pET32a-CsPPO43、pET32a-CsPPO70、pMALc5X-CsPPO43、pMALc5X-CsPP070,利用E.coil Transetta(DE3)菌株在IPTG诱导下表达,经SDS-PAGE 电泳检测得到对应四种原核表达蛋白,pET32a-CsPPO43、pET32a-CsPPO70 表达的蛋白集中在沉淀中,而 pMALc5X-CsPPO43、pMALc5X-CsPPO70表达的蛋白出现在大量存在上清液中,结果表明通过pMALc5X原核表达载体能够表达出可溶性蛋白。(4)在pH值分别为4.0、5.6、6.5条件下,以邻苯二酚为底物,测定四种融合蛋白的酶比活力变化,结果表明pH值为5.6时四种融合蛋白酶比活力相对比较高。利用pH值为5.6为测定条件,检测邻苯二酚、EC、ECG三种物质作为底物时四种融合蛋白的比活力变化,结果表明酶比活力的变化在测定范围内基本上呈现出‘S’变化。四种融合蛋白酶与EC反应的比活力较高,其中,pMALc5X-CsPPO43与EC酶比活力最高,最大比活力为1.45×106 U·mg-1。因此,pMALc5X-CsPPO43可为体外酶促氧化法制备茶黄素酶源的获得提供一个选择。