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目的:建立稳定高表达PIG11(p53-induced protein 11,p53诱导基因11)蛋白的HepG2细胞株,研究PIG11诱导细胞凋亡过程中的ROS(reactive oxygen species,活性氧)和线粒体改变,阐明PIG11诱导细胞凋亡的分子机制。方法:采用本课题组已冻存的pLXSN-PIG11逆转录病毒液,在polybrene协助下感染HepG2细胞,经G418筛选,获得稳定表达PIG11蛋白的HepG2细胞,Western Blot和免疫细胞化学染色鉴定感染后HepG2细胞PIG11蛋白的表达情况。DNA Ladder、PI染色流式检测细胞的凋亡情况。用Rh123(rhodamine 123)标记,流式测定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,Δψm)。Western Blot检测胞浆和线粒体组分中Cyt C的含量变化。DCFH-DA荧光探针标记细胞内ROS,流式检测ROS水平的改变。结果:成功建立稳定高表达PIG11蛋白的HepG2细胞株,Western Blot及免疫细胞化学检测证实PIG11蛋白高表达。PI染色流式凋亡检测结果显示pLXSN-PIG11-HepG2细胞凋亡率为18.60%±1.25,高于HepG2组(3.81%±0.46)和pLXSN-HepG2组(6.03%±0.97)(P<0.01)。pLXSN-PIG11-HepG2细胞可见明显的DNA Ladder条带,而HepG2组和pLXSN-HepG2组细胞均未见明显的DNA ladder出现。流式细胞仪检测Rh123荧光强度,结果显示:pLXSN-PIG11-HepG2细胞荧光强度(5.4±0.15)显著低于HepG2细胞(14.7±0.56)和pLXSN-HepG2细胞(13.2±0.53)(P<0.01)。用CsA(10μM)抑制各组细胞的线粒体通透性转移孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)后,流式凋亡检测结果显示pLXSN-PIG11-HepG2细胞凋亡率明显降低。Cyt C的Western Blot检测发现存在线粒体损伤及之后的Cyt C向胞浆释放。流式测定胞内ROS水平变化,结果显示pLXSN-PIG11-HepG2细胞内ROS水平(15.60±0.92)明显高于pLXSN-HepG2细胞(4.90±0.70)和HepG2细胞(5.37±1.17)(P<0.01)。NAC(10mM)清除各组细胞内的ROS后,流式凋亡检测结果显示清除胞内ROS的pLXSN-PIG11-HepG2细胞凋亡率(7.75%±0.34)较未清除ROS的pLXSN-PIG11-HepG2细胞凋亡率(18.60%±1.25)有明显降低。CsA(10μM)抑制各组细胞的MPTP后,pLXSN-PIG11-HepG2组ROS降低至8.10±0.30(P<0.05)。结论:成功获得稳定高表达PIG11蛋白的HepG2细胞株;PIG11高表达可诱导HepG2细胞凋亡;PIG11诱导细胞凋亡机制可能由胞内ROS变化和线粒体损伤介导。