【摘 要】
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禽白血病（Avian leukosis,AL）是禽类感染禽白血病病毒（Avian leukosis viruses,ALV）造成的一种接触性、传染性、肿瘤性的病毒病,以淋巴细胞性白血病、髓细胞性白血病、结缔组织性肿瘤等为主要临床特征,严重阻碍了养禽业的健康发展,该病也成为危害禽类的重要传染病之一。ALV的检测方法较多,但能在短时间内鉴别不同亚群的方法较少;此外,ALV亚群多,鸡对ALV抗原成分的免
【基金项目】
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2019年度贵州省级农业科技支撑计划项目,贵州地方品种鸡ALV快速检测与中药控制关键技术研究,黔科合支撑[2019]2286； 贵州大学2020年省级教学内容和课程体系改革项目,线上线下混合式教学《兽医免疫学》课程建设,GZJG20200035； 贵州省科技平台及人才团队计划,贵州省动物生物制品工程技术研究中心,黔科合平台人才[2
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禽白血病（Avian leukosis,AL）是禽类感染禽白血病病毒（Avian leukosis viruses,ALV）造成的一种接触性、传染性、肿瘤性的病毒病,以淋巴细胞性白血病、髓细胞性白血病、结缔组织性肿瘤等为主要临床特征,严重阻碍了养禽业的健康发展,该病也成为危害禽类的重要传染病之一。ALV的检测方法较多,但能在短时间内鉴别不同亚群的方法较少;此外,ALV亚群多,鸡对ALV抗原成分的免疫反应较差,目前还没有有效的疫苗和特效治疗药物,筛选出具有抗肿瘤中药对防控ALV有一定的意义。因此,本研究拟建立可同时检测A/B/J三个亚群的多重PCR方法;分离鉴定ALV毒株,以了解ALV在贵州的流行趋势;以分离的ALV毒株为研究对象,探究四种中药提取物对其复制的影响,以筛选出具有抗ALV的药物。主要内容如下:1.禽白血病病毒A/B/J亚群三重PCR检测方法的建立及初步应用试验根据Gen Bank数据库中登录的ALV-A、ALV-B和ALV-J原型株基因组gp85基因的核苷酸序列利用Primer Premier 7.0软件,分别设计了3对特异性引物,建立了一种能同时检测3个亚群的三重PCR方法,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检验,并进行了临床初步试验。结果显示,该方法对携带有不同亚群ALV gp85基因序列的质粒有特异性扩增,而对传染性法氏囊病病毒、马立克病病毒、禽腺病毒、禽流感病毒和新城疫病毒的核酸均无特异性扩增,说明本研究建立的三重PCR具有较强的特异性;对携带有不同亚群ALV gp85基因序列的质粒的最低检测量分别为11.7 pg、1.17 pg、11.7 fg,说明本研究建立的三重PCR具有较高的敏感性;该方法对携带有不同亚群ALV gp85序列的质粒模板均能扩增出与预期大小一致的目的条带,说明本研究建立的三重PCR重复性较好;临床初步应用结果显示,三重PCR方法对2份ALV-A样本的检出率为100%,对18份为ALV-J样本的检出率为88.9%,说明本研究建立的三重PCR具有一定的临床适用性。本试验建立的三重PCR方法具有操作简单、成本低廉、特异性高、稳定性好的优点,可为临床上快速鉴别A、B、J亚群ALV提供重要的技术支持。2.ALV毒株分离鉴定、全基因组测序及生物信息学分析试验将PCR检测为ALV阳性的16份病料制备成病毒悬液分别接种至DF-1细胞培养7 d并盲传一代,使用p27群特异性抗原ELISA试剂盒检测,分离鉴定出3株J亚群ALV毒株,分别命名为GZ20CS-1株、GZ20CS-2株和GZ20LPS株,并对其进行了全基因组扩增、克隆、测序和生物信息学分析。结果显示,3株分离毒株全基因组核苷酸序列分别长为7 795 bp、7 718 bp和7 776 bp;3株分离毒株的TCID50分别为10-1.67/0.2 m L、10-3.25/0.2 m L、10-1.67/0.2 m L;全基因组核苷酸序列同源性分析结果显示3株分离毒株的核苷酸序列同源性在96.5%～99.6%之间,与不同亚群ALV参考毒株的核苷酸序列同源性在82.2%～94.6%之间,与J亚群ALV的核苷酸同源性比其他亚群高,在93.0%～94.6%之间,证明3株分离毒株均为J亚群ALV毒株,遗传进化树结果显示分离毒株与ALV-J亚型在同一分支;env基因核苷酸序列同源性分析和遗传进化树构建结果与全基因组比对结果一致;env基因编码氨基酸突变位点分析结果显示:GZ20LPS株有14处突变,GZ20CS-1和GZ20CS-2株有12处突变,3株ALV分离毒株的突变位点主要集中在hr1区、hr2区。3.不同中药提取物对ALV复制作用的影响试验以分离的ALV-J GZ20CS-2株为研究对象,以CCK-8法测定黄芪多糖、苦参碱、黄连素和茶多酚四种待试中药提取物对DF-1细胞的最大安全浓度,将配制成100TCID50的病毒液与最大安全浓度的待试中药分为预防组、治疗组和综合组接种至DF-1细胞,提取细胞组RNA转录为c DNA,以ALV gp37为特异性引物进行q PCR扩增,从基因水平探索中药对ALV复制作用的影响;分别于ALV感染后的第3 d和第5 d收集细胞样品,采用Western Blot方法从蛋白水探索中药对ALV复制作用的影响。结果（1）最大安全浓度结果显示,黄芪多糖、苦参碱、黄连素和茶多酚四种中药的最大安全浓度分别为10 mg/m L、400μg/m L、80μg/m L和2 mg/m L;（2）基因水平表达结果显示:黄芪多糖可明显下调ALV-J GZ20CS-2株gp37基因的表达,茶多酚、苦参碱和黄连素也具有一定的下调作用,但效果不如黄芪多糖明显,总体来说治疗组效果较好;（3）蛋白水平表达结果显示:黄芪多糖能明显抑制ALV-J GZ20CS-2株p27蛋白的表达,茶多酚、苦参碱和黄连素也具有一定的抑制作用,总体来说综合组效果较好。
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