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角膜炎症是眼科最常见的疾病之一,而复杂的细胞因子网络在角膜炎症中发挥了重要的调控作用。因此,关于细胞因子的研究对揭示角膜炎症的发病机制,寻找新的治疗干预靶点具有非常重要的意义。高迁移率族蛋白1(HMGB1)作为一种晚期炎症介质,它既是炎症的早期启动者(HMGB1从坏死细胞的被动释放),又是炎症晚期的促进者(巨噬细胞主动分泌HMGB1),然而,目前我们尚未发现HMGB1在眼表疾病的相关研究。此外,胞外HMGB1需与相应胞膜受体结合才能发挥其生物学效应。HMGB1已知的受体包括晚期糖基化终产物受体(RAGE)、TOLL样受体(TLR)2及4,其中TLR2和TLR4受体在角膜上皮细胞的表达已有报道,但目前尚无角膜上皮细胞表达RAGE受体的相关研究。因此,本实验的目的在于探讨角膜缘上皮细胞是否存在RAGE受体的表达,及HMGB1是否对角膜缘上皮细胞存在生物学效应。
本研究首先建立人角膜缘上皮细胞的体外培养方法,探讨角膜缘上皮细胞是否存在RAGE受体的表达。我们收集了角膜移植术后的角巩膜环,分别使用CnT20和DMEM全培养基,采用组织块培养法培养角膜缘上皮细胞,并对第三代细胞采用免疫荧光法进行AE5的鉴定。然后通过免疫荧光法和RT-PCR技术对正常角膜组织的冰冻切片和培养细胞进行RAGE受体表达的检测。我们发现与DMEM全培养基相比,CnT20无血清培养基更有利于角膜缘上皮细胞的体外培养。并且,CnT20无血清培养基培养的第三代角膜缘上皮细胞存在角蛋白3的表达,证实了培养的细胞为角膜上皮细胞来源,因此可以用于本实验的后续研究。同时,免疫荧光和RT-PCR技术验证角膜缘上皮细胞有RAGE受体的阳性表达,主要在细胞膜上表达,为HMGB1对角膜缘上皮细胞存在生物学效应的猜想提供生物学基础。
然后,本研究从细胞增殖、凋亡、迁移三方面研究HMGB1对角膜缘上皮细胞的生物学效应。我们采用CCK8法检测HMGB1对角膜缘上皮细胞增殖的影响;采用流式细胞仪、共聚焦荧光显微镜检测HMGB1对角膜缘上皮细胞凋亡的影响;采用划痕实验探讨HMGB1对角膜缘上皮细胞迁移的影响。结果发现HMGB1对角膜缘上皮的增殖和迁移存在双向调节作用,即低浓度时表现为促进作用,而高浓度时表现为抑制作用。此外,HMGB1对角膜缘上皮的凋亡存在明显的促进作用。上述结果表明高浓度的HMGB1能抑制角膜缘上皮细胞的增殖和迁移,并促进细胞的凋亡,因此不利于角膜上皮的修复,延缓角膜上皮的愈合,可导致炎症的迁延不愈。
最后,本研究探讨了HMGB1对角膜缘上皮细胞细胞因子表达的影响。通过免疫荧光和ELISA技术,我们初步发现HMGB1可以促进VEGF、NFkappaB、TNF-α、IL-1β的表达,促进NFkappaB的核转位。这说明HMGB1可能通过调控炎症因子和促新生血管因子的表达而参与角膜炎症的发生发展,因此有可能是干预角膜炎症的一个治疗靶点。
综上所述,本研究首次验证了角膜缘上皮细胞存在RAGE受体的表达,并发现HMGB1参与了角膜缘上皮细胞的增殖、凋亡、移行及细胞因子分泌的调节。本研究揭示了HMGB1对角膜缘上皮细胞存在多种生物学效应,为寻找角膜炎症的治疗靶点提供了线索和科学依据。