恶性肿瘤是经济日益发展的今天导致死亡的重要病因之一,目前全世界有超过2000万肿瘤患者,并以每年超过1000万肿瘤病人的速度新增,每年有600万患者因肿瘤死亡。发展中国家肿瘤患者占全世界的半数以上。在高收入国家因恶性肿瘤导致的死亡占总死亡率的20%,在贫困国家仅占10%。在发达国家及发展中国家肿瘤都是对公众健康事业的极大威胁。中国现已成为世界第二癌症高发国。因为酒精、烟草等因素的不良刺激,口腔癌高发,位于恶性肿瘤发病率的第八位[34]。在中国,口腔癌也是常见的头颈部肿瘤[5-8]。在口腔癌中,最常见的就是口腔舌鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OTSCC)。由于舌是一个活动的器官,且具有丰富的血运和淋巴引流, OTSCC极易发生侵袭转移,临床进展和预后较其他的口腔癌差。在过去的数十年,OTSCC的发病率逐年上升,而治疗的临床疗效始终不佳,易发生肿瘤的早期侵袭和转移。骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)是一种广泛分布的多种功能分泌型钙结合磷酸化糖蛋白,对细胞的生长起着重要作用。它在许多组织和体液中存在,是重要的粘附和信号转导分子,在细胞粘附、骨转化、信号转导、血管重构、细胞免疫中都起着重要作用。最近的研究显示,OPN在多种肿瘤中均高表达,如乳腺癌、肺癌、胃癌、间皮瘤。推测OPN与许多细胞表面的受体蛋白结合后在肿瘤的恶性转化、发展、侵袭和转移的病理生理过程中发挥重要作用。有学者认为OPN可作为肿瘤基因治疗的靶点之一。癌胚抗原相关细胞粘附分子-5(Carcinoembryonic Antigen-related Cell Adhesion Molecule5, CEACAM5)的域结构是N-A1-B1-A2-B2-A3-B3,它是人类组织分化和肿瘤细胞分化和增殖的重要调节分子。然而目前对CEACAM5的研究较少,它在OTSCC中的作用尚无研究,它和OPN在肿瘤中的相关性更无从得知。本研究拟以人OTSCC组织和舌鳞癌细胞系Tca8113细胞为研究对象,采用多种技术方法,明确OPN和CEACAM5在OTSCC中的表达,及是否存在协同作用,同时利用siRNA干扰技术沉默OPN和CEACAM5基因,探讨其对OTSCC增殖及侵袭特性的影响,将对制订更为合理的肿瘤基因治疗策略提供新的思路与有效靶点。目的：1.通过对人OTSCC组织及正常舌组织的免疫组化、免疫组化双标记及Real-time PCR等方法,观察OPN CEACAM5在舌癌及正常舌组织中表达情况的相关性,研究OPN与CEACAM5在组织的关系及相互作用。2.通过免疫组化、免疫共沉淀、侵袭实验及siRNA干扰等方法,观察OPN与CEACAM5在人舌癌细胞株Tca8113及人口腔粘膜角质形成细胞(Human Oral Keratinocytes, HOK)(?)的表达情况及相关性,探讨OPN与CEACAM5在细胞中的关系及相互作用。研究方法：1.以OTSCC为研究对象,检测OTSCC组织中OPN与CEACAM5的表达及相互关系。我们于2008-2010年在山东大学齐鲁医院口腔科共收集OTSCC80例及40例正常舌组织,正常舌组织的来源为与舌癌临近的正常舌组织。临床资料包括年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分期及肿瘤分化程度。应用免疫组化及免疫组化双标记方法检测OPN与CEACAM5在OTSCC及正常舌组织中的表达及定位,分析OPN与CEACAM5在OTSCC和正常舌组织中表达异同及其相关性,并进一步分析蛋白表达的不同与肿瘤的侵袭及分化的关系。2.以OTSCC组织及正常组织为研究对象,进一步检测OPN与CEACAM5在OTSCC与正常舌组织中表达的差异。应用Real-time PCR方法进一步检测舌癌组织及正常舌组织中OPN及CEACAM5的表达情况。取小量舌癌及正常舌组织块,应用Trizol方法提取组织中的总RNA,在一定的反应体系中逆转录成cDNA, Real-time PCR方法检测舌癌组织及正常舌组织块中OPN与CEACAM5在mRNA水平的表达情况。3.人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113的培养及HOK的培养及生物学特性。口腔舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113在37℃,5%CO2饱和湿度条件下,培养于含15%胎牛血清,100IU/ml青霉素、100ug/ml链霉素的1640培养液中。HOK细胞的原代培养：无菌条件下收集人正常粘膜组织,放置于含OKM的培养皿中,用含三抗的(青霉素100mg/l,链霉素100mg/L,两性霉素B3mg/L)的D-Hanks液洗净血迹,剪成碎块,大小约5mm*5mm,去除粘膜下组织,0.25%Dispase (Sigma)4℃消化14小时,将粘膜层与粘膜下层用眼科剪分开,粘膜层用37℃0.25%胰蛋白酶(Gibco)振荡消化5分钟,收集上清,加入OKM培养基终止消化,制成细胞悬液置于OKM培养液中培养。用相差显微镜每天进行细胞形态学观察,同时绘制细胞生长曲线。4.以Tca8113细胞及HOK细胞为研究对象,在基因水平检测0PN与CEACAM5在两种细胞中的表达情况。收集生长旺盛的Tca8113细胞及HOK细胞。Trizol方法提取细胞总RN A,在一定的反应体系中逆转录成cDN A, Real-time PCR方法检测OPN与CEACAM5两种蛋白分子在mRNA水平的表达情况。5.以Tca8113细胞及HOK细胞为研究对象,应用免疫共沉淀技术,检测OPN及CEACAM两种分子分别在Tca8113细胞及HOK细胞中的表达及相互作用。6.以Tca8113细胞为研究对象,利用RNAi技术干扰0PN基因及CEACAM5基因的表达。用OPN-siRNA及CEACAM5-siRNA分别及共同对Tca8113细胞中OPN及CEACAM5基因进行沉默,利用Real-timePCR及Western blot检测干扰效率,利用MTT法检测OPN及CEACAM5基因沉默后对Tca8113(?)(?)胞增殖能力的影响。7.利用细胞侵袭实验检测OPN及CEACAM5两种分子对Tca8113细胞侵袭力的影响。于干扰后第3天取不同组别的Tca8113细胞,调整细胞悬液浓度为2*106,将100ul的细胞悬液加入Transwell小室中,评价两种蛋白对Tca8113细胞侵袭力的影响。结果：1.在舌癌组织及正常舌组织中均有CEACAM5及OPN两种蛋白的表达,但是表达方式不同。在正常舌组织中,OPN蛋白主要表达在细胞浆中,而CEACAM5则表达于细胞膜上；在舌癌组织中,两种蛋白分子的表达及表达强度均强于正常舌组织,而且这两种蛋白分子均表达于细胞浆中。通过对正常舌组织和舌鳞状细胞癌两种组织的免疫组化双标记发现,在正常舌组织中,没有发现OPN和CEACAM5两种蛋白分子的共表达；在舌鳞状细胞癌组织中,可以发现OPN和CEACAM5共同表达于细胞浆中,而且这种共表达率及表达强度与肿瘤的分化侵袭程度相关。2.通过Real-timePCR发现,在舌癌组织中,OPN及CEACAM5的表达均明显强于正常舌组织,这一结果与免疫组化结果相吻合。3.倒置显微镜下观察发现,Tca8113细胞均呈贴壁生长,形成单层结构。细胞呈多角形及梭形,轮廓清晰,细胞间结构紧密,生长旺盛。原代培养的HOK细胞,刚获取的细胞形态多为多角形扁平细胞及球形细胞。接种24-48小时后贴壁生长,细胞为圆形,随着生长,细胞伸出短小伪足,细胞呈扁平多角形,折光性低,形成多个小克隆。培养的细胞具有扁平不规则多角形,核圆,清晰,细胞质丰富、均匀。接种5天后细胞增殖加速,数量增多,克隆增大,大约2-3周细胞长满培养瓶。传代细胞24h左右可贴壁,第2-3代细胞形态与原代相似,从第四代起,细胞增殖速度减慢。4.分别收集生长旺盛的Tca8113及HOK细胞,分别提取总RNA.利用Real-timePCR方法检测OPN基因mRNA及CEACAM5基因mRNA的表达。结果表明在Tca8113细胞中OPN基因nRNA及CEACAM5基因mRNA的表达较HOK细胞强。5.收集生长旺盛的Tca8113及HOK细胞,分别提取总蛋白,利用western blot检测OPN蛋白及CEACAM5蛋白的表达。结果表明在Tca8113及HOK细胞中,均可表达OPN及CEACAM5分子,且在Tca8113细胞中的表达较HOK细胞强；免疫共沉淀结果显示Tca8113细胞中OPN及CEACAM5可以相互结合,而在HOK细胞中则无相关性。6.利用siRNA干扰Tca8113细胞中OPN及CEACAM5的表达,检测干扰效率,应用细胞侵袭实验分析单独干扰OPN、CEACAM5及联合干扰时对Tca8113细胞的作用,结果表明单独干扰OPN及CEACAM5均能减弱Tca8113细胞的侵袭力,联合干扰时Tca8113细胞侵袭力减弱更为明显。结论：1.在正常舌组织中CEACAM5表达在细胞膜,而在舌癌组织中该分子则表达在细胞浆中,CEACAM分子这种表达位置的变化可能在肿瘤的分化转移中起着重要的作用。2.OPN及CEACAM5两种分子均在在舌癌中表达,并且均表达在细胞浆中,在舌癌组织中两种分子可能作为一个功能复合体起作用,而且共表达的强弱与肿瘤的分化程度及侵袭力呈正相关。3.应用基因干扰技术,在Tca8113细胞验证了OPN与CEACAM5可能作为一个功能复合体在肿瘤的增殖和侵袭中起着重要作用,可能作为未来基因治疗的一个靶点。