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冠心病已经成为危害全人类健康的常见病及多发病,并且发病年龄越来越年轻。现代医学在冠心病病理生理、诊疗技术等方面的突飞猛进,给中医及中西医结合诊治心血管病的传统诊疗方法带来了极大的挑战。尽管近年来中西医结合诊治冠心病研究取得了较大进展,但仍存在许多问题和难点。代谢组学是一门在新陈代谢的动态进程中,系统研究代谢产物的变化规律,揭示机体生命活动代谢本质的科学。本研究首次运用基于GC-TOF/MS的代谢组学技术平台进行冠心病中医辩证分型的代谢组学研究。通过调查冠心病患者临床资料及其中医证候,并检测血清代谢组学变化规律,探讨冠心病人与健康人之间、冠心病各中医证型之间的代谢组学差异,为冠心病的中医证型客观化研究提供参考依据,探讨中医证型的分子生物学机理。
1.代谢组学的条件及方法的建立
目的:选择最佳的检测条件,建立代谢组学研究方法。
方法:安捷伦GC6980 GC与PegasusⅢ TOFMS串联连接。所选择最佳的GC-TOF/MS操作条件是:进样量1μl,采用不分流进样模式;氦气是载气,恒流速度是1 ml/min,采用程序升温模式;进样口温度:250℃;清洗时间和流速:1min,20ml/min;传输管温度:250℃;离子源温度:200℃;离子源电压和电流:-70 eV,3.0 mA;MS采用全扫描方式进行数据采集,扫描范围是m/z50-800,速度是20spectra/s,有160 s的溶剂延迟,检测电压是-1650v。
结果:通过对血清提取和衍生化,用GC/MS分析疾病组和健康对照组的样品。得到每个个体的数据和GC/MS谱图信息,每个时间点都对应着荷质比从50到800质谱信息,每个保留时间点所示峰强度是所有总离子之和,一个可见峰可能含有数个化合物信息。应用PCA和PLS对数据进行分析处理,得到样本分布散点图并进行组间分析。将具有显著意义的组份输入计算机,在建立的化合物库里查询对应化合物,发现有关化合物。
结论:运用以上方法得到的样本散点图,可以有效区分疾病组和健康对照组。
2.异丙肾上腺素诱导大鼠心肌缺血损伤的代谢组学研究
目的:进行心肌缺血中医证大鼠模型的代谢组学研究,从而探索和揭示中医“病证”的发生发展内在机制。
方法:以异丙肾上腺素结合肾上腺素加冰水刺激,以及异丙肾上腺素结合小站台水环境法剥夺睡眠分别建立心肌缺血心血淤阻证和心肌缺血气阴两虚证大鼠模型,运用基于GC-TOF/MS检测技术的代谢组学方法分析血清中的内源性小分子代谢物。
结果:两种中医病证型和正常大鼠三组间GC代谢谱图存在明显差异,数据处理和模式识别后,样品分布散点图中各组区分清晰。与正常大鼠相比,模型大鼠血清乳酸、羟脯氨酸、苏丁糖酸、柠檬酸、葡萄糖等化合物的相对含量均发生了显著变化,两种“病证”大鼠间血清缬氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸、呋喃半乳糖、2-羟基丁酸、3-羟基丁酸、赖氨酸等化合物的相对含量存在显著差异,提示这些化合物可能是区分两种中医病证的生物标志物。通过追溯代谢通路发现这些代谢物的变化与柠檬酸循环、糖代谢、氨基酸代谢等的异常密切相关。
结论:运用代谢组学研究技术可以从整体上对心肌缺血中医证型动物模型进行综合评价,并为揭示它们生物学本质提供科学依据。
3.冠心病中医辨证分型与临床指标相关性研究
目的:探讨冠心病(CHD)常见中医证型与冠状动脉造影(CAG)及血脂水平等相关临床指标之间的关系。
方法:对96例冠脉造影确诊为CHD的患者进行同步中医辨证分型,并检测其血脂水平,再将以上结果作对照。
结果:CHD患者中医证型中痰阻心脉证比例最大,占37.50%,其次为气虚血瘀证,占21.88%,阳气虚衰证最少,仅占2.08%,其余证型分布较均匀,气阴两虚证、气滞血瘀证以及心血瘀阻证分别占16.67%、11.46%和10.42%.气虚血瘀证、痰阻心脉证和心血瘀阻证多为三支病变,气阴两虚证多为双支病变,气滞血瘀证则多发单支病变。气虚血瘀证和阳气虚衰证平均狭窄程度最重,分别为81.1%和85.0%,气滞血瘀证病变程度最轻,为67.1%,且与气虚血瘀证有显著差别。各个证型的甘油三酯(TG)均显著高于正常对照组,其余血脂、脂蛋白水平基本正常。
结论:随冠脉病变部位及程度不同,CHD的证型分布各有特点,CAG结果及血脂水平与中医证型有一定的相关性。
4.冠心病中医辨证分型的代谢组学研究
目的:将传统中医辨证方法同现代系统生物学理论相结合,探讨冠心病中医辨证分型与基于GC-TOF/MS的血清代谢组学的关系。
方法:参照《中药(新药)临床研究指导原则》,收集90例高血压病患者以及29例健康人。选取的冠心病患者辨证分为痰阻心脉、气阴两虚、气虚血瘀及气滞血瘀四型。应用GC-TOF/MS测定健康人及不同中医证型的冠心病患者血清内源性代谢物,并用偏最小乘方分析法(PLS-DA)分析其代谢谱。
结果:PLS-DA分析的结果表明:该方法不仅可以有效区分疾病组和健康对照组,且男性患者中气虚血淤型和痰阻心脉型可明显区分开来;女性患者中气虚血淤型、痰阻心脉型和气阴两虚型冠心病患者间可明显区分开来。
结论:冠心病患者与健康人、以及冠心病中医证型在代谢组学方面的差异,为冠心病的中医证候研究提供了物质基础和分子生物学诊断指标,提示代谢组学(气质联用技术)可能成为高血压病的病因病机以及中医辨证分型新的研究手段。基于GC-TOF/MS和模式识别的代谢组学技术在揭示传统中医理论本质上有着广泛的应用前景。