急性心肌梗死（Acute myocardial infaction, AMI）等缺血性心脏病仍然严重威胁人类的生命健康，AMI后慢性心力衰竭患者的远期生存率低，预后差，传统的治疗手段均难以从根本上恢复心肌细胞数量，改善心脏舒张和收缩功能。干细胞移植为AMI的治疗开辟了一条崭新的措施与方法，有望从根本上改善梗死后心脏功能，因此近年来备受关注。骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）因为其特有的性质，而成为干细胞移植领域最具有潜力的候选细胞。然而，MSCs移植治疗AMI的突出问题是干细胞的植入问题，即难以实现足量的MSCs到达病变部位并存活。许多学者也提出采取联合基因或药物的方法提高MSCs的归巢。中医药治疗缺血性心脏病有一套完整的理论体系，应用益气活血中药治疗缺血性心脏病，临床疗效显著，既往实验证明益气活血中药对MSCs移植治疗急性心肌梗死具有协同作用，然而，中药的协同作用是否与促进MSCs向缺血心肌的趋化迁移有关？据此，我们展开了以下实验研究。目的1.体外观察益气活血中药单体对MSCs迁移的影响。2.在体观察益气活血中药复方对MSCs向缺血心肌趋化迁移的影响。3.从趋化因子受体CXCR4表达水平的变化探讨益气活血中药促进MSCs迁移的作用机制。4．从Notch信号通路探讨益气活血中药促进MSCs迁移的作用机制。方法1.采用全骨髓贴壁法分离培养小鼠骨髓MSCs，从表面分子标志及分化能力两方面对所培养的细胞进行鉴定。流式细胞仪检测（FACS）MSCs表面分子标志，并将MSCs向成骨细胞诱导分化，采用茜素红染色。2.用不同浓度的中药单体丹参酮ⅡA、黄芪甲苷作用于第3代骨髓MSCs72h，进行CFSE染色，应用FACS分析CFSE的荧光强度，进行最佳药物浓度的筛选。3.用最佳药物浓度的丹参酮ⅡA、黄芪甲苷及二者的联合干预第3代骨髓MSCs72h后，采用transwell装置，进行MSCs对SDF-1α的体外迁移实验。4.对益气活血中药芪丹通脉片进行拆方，SD大鼠随机分为益气组、活血组、复方组、对照组，灌胃给药14d，之后建立大鼠急性心肌梗死模型，将经Dio标记的MSCs通过尾静脉移植到大鼠体内，移植3d后采用荧光显微镜观察及FACS分析缺血心肌部位Dio阳性细胞在各实验组的差别，4w后采用多导生理记录仪比较各实验组心功能的改善状况。以上内容是益气活血中药促进MSCs迁移的离体、在体功能实验。5.以下内容是益气活血中药促进MSCs迁移的机制研究。采用免疫荧光染色对MSCs的CXCR4表达与分布进行观察。用最佳药物浓度的丹参酮ⅡA、黄芪甲苷及二者的联合干预第3代骨髓MSCs72h后，采用FACS、real-timePCR、western blot的方法检测各药物干预组MSCs的CXCR4的表达差异。并用CXCR4的阻滞剂AMD3100干预各实验组后，进行transwell体外迁移实验。6.用PCR琼脂糖凝胶电泳的方法观察分析MSCs的Notch受体、配体表达。然后用RBP-J基因敲除小鼠来源的MSCs以阻断Notch信号通路，采用FACS、real-timePCR、western blot的方法检测RBP-J-/-组及RBP-J-/+组MSCs的CXCR4表达差异。7.用最佳药物浓度的黄芪甲苷、丹参酮ⅡA及二者的联合干预第3代骨髓MSCs72h后，用real-timePCR方法检测各药物干预组Notch信号通路的下游靶基因HES1mRNA，HES5mRNA的表达差异。结果1. MSCs的表面抗原分子CD34、CD45和MHCⅡ阴性，CD29、CD44、CD90、CD106和Sca-1均为阳性。茜素红矿化结节染色呈阳性，MSCs能够定向诱导分化为成骨细胞，可证明其具有分化潜力。因此，获得的细胞符合骨髓MSCs特征。2. CFSE增殖实验结果显示：丹参酮ⅡA浓度为0.2μg/mL时，MSCs增殖最快，与浓度为0.1μg/mL、0.4μg/mL时比较，P<0.05，其差异均有统计学意义；黄芪甲苷在浓度为0.4μg/mL时，MSCs增殖最快，与浓度为0.2μg/mL、0.8μg/mL时比较，P<0.05，其差异均有统计学意义。故丹参酮ⅡA，黄芪甲苷浓度分别为0.2μg/mL，0.4μg/mL时为药物的最佳浓度。3.最佳药物浓度的丹参酮ⅡA、黄芪甲苷及其联合组（T+A）作用于MSCs，进行体外迁移实验的结果显示：对于MSCs迁移的影响，各组之间有明显的差异，P<0.05。T+A组较其余组迁移细胞数增加，有统计学意义P<0.05，丹参酮ⅡA组较黄芪甲苷组迁移细胞数增加，有统计学意义P<0.05，黄芪甲苷组较对照组迁移细胞数增加，有统计学意义P<0.05。4.成功建立了大鼠急性心肌梗死模型。MSCs移植后3d，运用FACS分析或荧光显微镜下观察Dio阳性MSCs到达缺血心肌的数量，结果一致，各组间比较结果显示：芪丹通脉片组Dio阳性细胞数分别高于益气组、活血组与对照组，有显著性差异（P<0.05）；活血组Dio阳性细胞数高于益气组和对照组，有显著性差异，（P<0.05）；益气组Dio阳性细胞数高于对照组，但统计学无显著性差异，（P>0.05）。而各实验组大鼠心肌冰冻切片SDF-1α免疫荧光染色结果未见明显差异。5． MSCs移植后4w，采用多导生理记录仪分析各实验组心功能改善情况，结果显示：芪丹通脉片组MAP、LVPSP、+LVdp／dtmax及-LVdp／dtmax均较对照组、益气组、活血组升高，其差异有统计学意义（P<0.05），对照组、益气组、活血组之间比较无显著差异（P>0.05）。6.激光共聚焦荧光显微镜观察可见CXCR4在细胞膜及细胞内均有表达，且多数表达于细胞内。运用FACS、real-timePCR、western blot检测各实验组MSCs上CXCR4的表达，结果均显示：联合用药组MSCs的CXCR4表达优于其余各组，有统计学意义（P<0.05）；丹参酮ⅡA组优于黄芪甲苷组，有统计学意义（P<0.05）。AMD3100阻断CXCR4通路后，抑制了各组药物对MSCs迁移的促进作用。7. PCR琼脂糖凝胶电泳结果表明MSCs有Notch受体和配体的表达。FACS、real-timePCR、western blot检测结果显示：RBP-J-/-组MSCs的CXCR4的表达高于RBP-J-/+组，有统计学意义（P<0.05）。中药单体干预MSCs后，检测HES1mRNA及HES5mRNA的表达变化，结果显示各实验组HES5mRNA的表达量均很少，无明显统计学差异。HES1mRNA的表达各用药组均较正常组减少，以T+A联合用药组下降最明显，有统计学意义（P<0.05）。丹参酮ⅡA组较黄芪甲苷组下降明显，有统计学意义（P<0.05）。结论1.益气活血中药可以促进MSCs向缺血心肌的趋化迁移，以复方作用最佳，活血药作用优于益气药。2.中药的作用机制可能是通过抑制MSCs的Notch信号通路以上调CXCR4的表达，从而发挥其促迁移的作用。