第一部分Nup98在急性病毒性心肌炎病人CD4+T细胞中的表达背景:急性病毒性心肌炎（AVMC）的是由病毒感染引起的心肌炎症性疾病。我们和国外的研究证实Th17细胞是介导AVMC进展的重要细胞。近些年核孔蛋白的作用越来越为大家所重视,Nup98是一种与病毒感染和细胞分化相关的重要核孔蛋白。但Nup98在AVMC病人CD4+T细胞中表达情况尚未阐明。方法:本研究招募2014年6月至2015年1月期间在华中科技大学同济医学院附属协和医院住院的21名AVMC病人（CVB3-IgM阳性）,并选择23名健康志愿者作为对照,所有研究对象都签署了知情同意书。取健康志愿者和AVMC病人静脉血,用流式细胞术检测外周血CD4+T细胞中Th17细胞的比例和数目,并分选出CD4+T淋巴细胞,用western blot检测Nup98及RORγt的蛋白表达情况,用ELISA检测血清IL-17含量。空斑试验检测健康志愿者和AVMC病人外周血CD4+T细胞中病毒滴度,利用RT-PCR技术检测CD4+T细胞中病毒mRNA表达。结果:与健康志愿者相比,AVMC病人外周血Th17细胞比例升高而且数目增多,血清中的IL-17水平升高（P＜0.05）。同时AVMC病人CD4+T细胞Nup98蛋白表达下降而Th17转录因子RORyt表达升高（P＜0.05）。AVMC病人外周血分离的CD4+T细胞中可以检测到病毒滴度,CVB mRNA表达也升高。结论:AVMC病人外周血CD4+T细胞中Nup98下调而Th17细胞比例及其分泌的IL-17增多,AVMC病人外周血分离的CD4+T细胞中可以检测病毒。第二部分Nup98在CVB3诱导的Th17细胞体外分化中的作用及机制背景:CVB3是一类小核糖核酸病毒科肠道病毒,是导致病毒性心肌炎的最主要病原体。在病毒性心肌炎中CVB3对心肌的直接损伤作用已为人所知。但CVB3对免疫细胞,尤其是CD4+T细胞的直接作用还不清楚。在前一部分的研究中,我们发现AVMC病人外周血CD4+T细胞中,病毒滴度升高,Nup98下降,Th17转录因子RORyt升高。CVB3是否能通过Nup98直接影响CD4+T细胞向Th17细胞分化还不清楚。方法:我们分离健康志愿者外周血CD4+T细胞,用CVB3病毒直接感染细胞后,收取上清和细胞进行后续空斑试验,流式细胞术,Western blot,RT-PCR以及ELISA检测。此外,我们利用CHO细胞和293T细胞分别作为阴性对照和阳性对照,检测CD4+T细胞表面两种柯萨奇病毒受体CAR和DAF表达情况,了解CVB3进入CD4+T细胞的途径。接着,通过体外转染Nup98 siRNA或Nup98质粒的方式,使CD4+T细胞中Nup98抑制或者过表达,流式细胞术检测Th17细胞比例,ELISA检测培养上清IL-17含量,Western blot分别检测CD4+T细胞中Nup98及RORyt蛋白水平,RT-PCR检测RORyt,Nup98,IL-17的基因表达。最后,用Western blot检测CD4+T细胞中p300/CBP,乙酰化Stat3/总Stat3以探究Nup98调控Th17细胞活化过程中可能激活的信号通路。结果:我们发现CVB3感染的CD4+T细胞组（CVB3组）可以形成空斑,病毒滴度为3.1*103PFU/ml,而模拟感染组（Mock组）无空斑形成（P＜0.05）。Western blot和ELIS A显示,与Mock组相比,C VB3感染组的Th1 7细胞比例升高（P＜0.05）,IL-17分泌增多（P＜0.05）。此外,CVB3感染组的细胞,Nup98在蛋白和基因水平表达都下降而RORyt表达增多（P＜0.05）。我们检测CD4+T细胞表面两种柯萨奇病毒常见受体CAR和DAF的表达情况,以了解CVB3进入CD4+T细胞的途径。结果显示,不论是未激活的CD4+T细胞还是用anti-CD3,anti-CD28激活的CD4+T细胞表面几乎不表达CAR,但是却高表达DAF。利用DAF单克隆抗体（mAb）拮抗后,CVB3感染组的病毒滴度明显下降（P＜0.05）。为了解Nup98对Th17细胞体外分化的直接作用,我们在体外转染Nup98 siRNA或Nup98质粒及相应的对照后进行检测。与对照组和空载质粒（pcDNA3.1）组相比,siRNA-Nup98转染组CD4+T细胞Nup98蛋白和基因表达下降,而Th17细胞比例,Th17相关的转录因子RORyt,Th17细胞分泌的IL-17均增多（P＜0.05）。此外,siRNA-Nup98转染组的p300/CBP和乙酰化Stat3表达显著升高（P＜0.05）。与之相反,pcDNA3.1-Nup98转染组Nup98上调,RORyt,p300/CBP和乙酰化Stat3表达受到抑制（P＜0.05）。各组总Stat3表达无明显差异。结论:CVB3是通过DAF而非经典的CAR进入人CD4+T细胞内,下调Nup98,通过影响p300/CBP-乙酰化Stat3-RORyt通路,直接促进CD4+T向Th17细胞分化。第三部分Nup98对急性病毒性心肌炎小鼠模型中Th17细胞分化的作用背景:CVB3诱导的VMC模型被广泛的用于病毒性心肌炎的研究中。本部分旨在利用VMC小鼠验证Nup98对急性病毒性心肌炎中Th17细胞分化的作用和对病毒性心肌炎病情严重程度的影响。方法:建立CVB3诱导的VMC小鼠模型。我们通过尾静脉注射向小鼠体内注入抑制剂（Nup98 siRNA）抑制小鼠体内Nup98的表达,尾静脉注射NC作为对照;尾静脉注射Nup98质粒（Nup98 pcDNA3.1）使Nup98过表达,尾静脉注射空载质粒（pcDNA3.1）作为过表达对照。观察并比较小鼠精神活动和毛色状况,记录小鼠心脏重量与体重。通过心脏组织病理学检查比较各组小鼠心肌炎症程度及形态变化。同时检测和记录各组小鼠血清cTNT含量,ELISA检测血清IL-17含量。流式细胞术检测各组小鼠心脏浸润Th17细胞比例。Western blot和RT-PCR检测各组小鼠脾脏CD4+T细胞Nup98以及RORyt水平。结果:与尾静脉注射NC的NC组小鼠和尾静脉注射PBS的VMC组相比,Nup98 siRNA组的小鼠CD4+T淋巴细胞Nup98表达明显降低,Th17细胞的转录因子RORyt表达升高,心脏体重比明显升高,HE切片示心肌炎症细胞浸润明显,心脏浸润的Th17细胞比例升高,血清IL-17含量升高（P＜0.05）。与之相反,与尾静脉注射空载质粒的pcDNA3.1组小鼠和尾静脉注射PBS的VMC组相比,质粒处理的VMC小鼠（Nup98 pcDNA3.1组）脾脏CD4+T淋巴细胞Nup98表达升高RORyt降低;心脏体重比明显下降,HE切片示心肌炎症缓解,心脏浸润的Th17细胞比例降低,血清IL-17含量降低（P＜0.05）。结论:通过尾静脉注射Nup98siRNA可以干预小鼠体内Nup98的表达和功能,促进Th17分化和IL-17分泌,促进心肌炎的进程;体内过表达Nup98能够减少VMC小鼠Th17分化,对心脏起着明显的保护作用。因此,针对Nup98调控Th17细胞可能成为治疗急性病毒性心肌炎的新靶点。