论文部分内容阅读
酵母菌胞外多糖（Yeast extracellular polysaccharide,YEPS）作为微生物多糖的一个大类,具有多种生理活性,可用于生产有机体免疫调节剂应用在食品与药品中,或作为潜在的天然抗氧化剂,具有广阔的市场前景。本研究以两株胶红酵母菌株（Rhodotorula mucilaginosa CM-1与Rhodotorula mucilaginosa CICC 33013）为研究对象,分别对其液体培养基进行分离、纯化得到单一组分胞外多糖RmEPS-11与REPS2-A,利用红外光谱（FT-IR）、离子色谱（ICS）、核磁共振（NMR）和甲基化分析等手段解析其初级结构;分析胞外多糖的抗肝癌通路及肝功能的保护机制;利用高通量测序技术对两株胶红酵母菌株进行了全局性转录组学分析,成功搭建了胶红酵母菌的转录组信息平台,为进一步研究胶红酵母菌产糖机制、挖掘产糖差异基因奠定了理论基础。主要研究结果如下:（1）从胶红酵母R.mucilaginosa CM-1液体培养基中分离得到水溶性胞外多糖RmEPS,其产量为7.35g/L。多糖RmEPS经分离纯化得到单一纯品RmEPS-11,结果表明,RmEPS-11是由摩尔比为1.3:4.4:7.8:86.4的阿拉伯糖（Ara）,半乳糖（Gal）,葡萄糖（Glc）和甘露糖（Man）组成,平均分子量为2.3×105Da。基于FT-IR,NMR和甲基化分析,确定了多糖组分RmEPS-11骨架是由（1→3）-连接的Man组成,分支上是由（1→2）-连接的Glc、（1→2,6）-连接的Gal和（1→2,3,4）-连接的Ara组成。此外,从胶红酵母R.mucilaginosa CICC 33013菌株培养液中提取分离出水溶性胞外多糖REPS,其产量为6.2g/L。多糖REPS经分离纯化得到单一多糖组分REPS2-A,结果表明,REPS2-A是由摩尔比为63.1:0.2:18.3:18.3的半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖（Glc）和甘露糖（Man）组成,平均分子量为7.125×106Da。基于FT-IR,NMR和甲基化分析,确定了多糖组分REPS2-A是高度分支的多糖,是由（1→3）-连接的Gal为骨架组成,分支是由（1→2）-连接的Glc、（1→4）-连接的Man、（1→3）-连接的Glc、（1→4,6）-连接的Man和（1→2,3,4）-连接的Ara组成。（2）考察了不同胶红酵母（R.mucilaginosa）菌株胞外多糖的抗氧化活性,实验结果显示,多糖组分RmEPS-11在浓度为8mg/mL时自由基清除活性达到66.15%、ABTS自由基清除活性为82.8%、还原力（0.753）和氧自由基吸收能力（560.38±6.45μMTE/g）。同时,多糖组分REPS2-A在浓度8mg/mL时DPPH自由基清除活性为49.1%,ABTS自由基清除活性为51.2%,还原力为0.352。由多糖抗氧化活性实验结果可知,在相同条件下,胶红酵母胞外多糖的分子量越小,其抗氧化能力越强。（3）研究了多糖组分RmEPS-11对小鼠异烟肼（INH）和利福平（RIF）引起的肝毒性的保护机制。结果显示,与INH和RIF处理的小鼠相比,多糖RmEPS-11给药后小鼠血清ALT、AST水平和肝脏MDA含量显著降低,肝脏SOD活性和GSH含量显著恢复。此外,肝脏的组织病理学损伤和凋亡肝细胞的数量也通过处理显著改善。多糖RmEPS-11保肝护肝机制研究表明,肝功能保护作用主要是由于CYP2E1 mRNA表达水平的调节,导致有害自由基和ROS的形成量减少,同时伴随着其抗氧化能力的显著诱导,多糖组分RmEPS-11通过抑制肝CYP2E1基因抑制脂质过氧化、增加自由基的清除能力达到护肝的效果。实验结果也验证了多糖组分RmEPS-11相比REPS2-A具有较高的自由基清除能力。（4）确定多糖组分REPS2-A对肝癌细胞Hep-G2抑制作用最佳的浓度及时效性。当多糖组分REPS2-A的浓度为1mg/mL时,肝癌细胞Hep-G2的抑制率高于IC50时的抑制率,抑制效果明显优于其它浓度。肝癌细胞Hep-G2的自发凋亡率是0.40%,当多糖REPS2-A浓度为1mg/mL,处理24h、48h与72h,肝癌细胞Hep-G2的凋亡率分别为77.70%、88.18%、97.08%。多糖组分REPS2-A使肝癌细胞Hep-G2阻滞发生在G1/S期。多糖组分REPS2-A能有效抑制肝癌细胞的增殖,且存在剂量效应。相比于多糖RmEPS-11,多糖组分REPS2-A具有显著的抑制肝癌细胞活性,主要归因于多糖组分REPS2-A是由（1→3）-连接的活性半乳糖（Gal）为骨架组成。（5）通过Illumina Hiseq 2000平台对胶红酵母R.mucilaginosa CM-1（RN）与R.mucilaginosa CICC 33013（RC）样品进行高通量转录组测序,结果显示,两株菌株共有差异表达基因1016条,上调基因527条,下调基因489条。差异基因GO富集分析显示了“生物学过程”与“细胞组分”富集的条目最多。差异基因KEGG富集分析结果显示,富集到“细胞周期-酵母”通路上的基因共有14个,呈显著富集,下调基因无显著富集。糖酵解（Glycolysis）途径中的关键酶如甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、乙酰辅酶A合成酶（ACSS）、乙醛脱氢酶（ALDH）与果糖二磷酸醛缩酶（FBAI）在KEGG通路中均表现出不同程度的上调表达,没有下调表达基因出现。通过差异表达基因分析发现,在胶红酵母R.mucilaginosa CM-1（RN）中,果糖二磷酸醛缩酶编码基因c14925gl和甘油醛-3磷酸脱氢酶编码基因c14905gl的转录水平相较于R.mucilaginosa CICC 33013（RC）上升非常显著,上调倍数分别为5.2279倍和6.4615倍。此外,胶红酵母R.mucilaginosa CM-1（RN）和R.mucilaginosa CICC33013（RC）的糖基转移酶基因表达水平存在较为显著的差异。首先,在胶红酵母R.mucilaginosa CM-1（RN）中,α-1,2-甘露糖基转移酶编码基因c13430gl的转录水平较R.mucilaginosa CICC 33013（RC）上调了1.3967倍。糖基转移酶转录水平的不同导致了两株胶红酵母胞外多糖一级结构组成的差异。研究发现,在R.mucilaginosa CM-1（RN）细胞中,葡萄糖苷水解酶编码基因c19749gl的转录水平相较于R.mucilaginosa CICC 33013（RC）上调了6.5689倍,转录水平差异非常显著。推测R.mucilaginosa CM-1（RN）胞外多糖的分子量较小是因为其细胞可能由于大量合成的葡萄糖苷酶而使得其多糖发生了一定水平的降解,致使分子量有所降低。在胶红酵母（R.mucilaginosa）三羧酸循环（TCA）中,基因gltA表达上调,基因ACLY表达下调,说明柠檬酸合成酶（gltA）与ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）基因在胶红酵母（R.mucilaginosa）胞外多糖差异性表达上也起到关键调节作用。通路分析结果发现,与调控胶红酵母（R.mucilaginosa）菌抗氧化、抗肿瘤等生理活动密切相关的MAPK信号通路和p53信号通路中的关键基因也出现表达差异,其中MAPK信号通路中基因STE12、MSN2,4与TEAD表达上调,基因CDC42与GNG表达下调。同样在p53信号通路中,基因ATR与CHK1均出现上调表达。证明上述基因在胶红酵母胞外多糖清除自由基活性能力、抑制肝癌细胞及保肝护肝等活性差异表达上起到重要的调控作用。