论文部分内容阅读
环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶,EC2.4.1.19)是糖基水解酶α-淀粉酶家族(家族13)的重要成员,它能通过环化反应将淀粉转化为环糊精(简称CD)。根据CGT酶反应起始阶段生成环糊精的主要类型,将CGT酶分为α-、β-和γ-CGT酶。随着α-环糊精在食品、分子识别和纳米材料等领域的广泛应用,a-CGT酶已成为当今研究的热点。本论文以所在实验室构建并保存的含分泌型信号肽OmpA的大肠杆菌E. coli BL21 (DE3){OmpA-pET-20b (+) /α-cgt}为出发菌株,以高产量、高分泌能力和高生产强度为目标,在摇瓶和3L发酵罐中研究了发酵培养基和培养条件对α-CGT酶的胞外分泌的影响。本论文主要研究内容如下：1、重组大肠杆菌在种子培养基中的最佳活化时间为6-8h。在摇瓶水平下,在菌体生长的对数前期添加0.75%(w/v)甘氨酸能有效地提高a-CGT酶的胞外产量,当发酵至36h时,胞外酶活达18.9 U/mL,是同期不添加甘氨酸的2.2倍。在摇瓶水平下,通过一系列单因素实验优化出的发酵培养基组成为：甘油10 g/L,工业级蛋白胨18 g/L工业级酵母粉20 g/L, K2HPO4·3H2O 16.43 g/L, KH2PO42.31 g/L, MgCl2 5mM,初始pH为7.0；发酵条件为：30℃,7%的接种量,装液量为20mL培养基/250mL三角瓶。在摇瓶条件下重组大肠杆菌胞外生产α-CGT酶的能力从发酵60h的20.5 U/mL提高到发酵48h的56.0 U/mL,生产强度从341.7 U/L/h提高到1166.7 U/L/h。2、采用优化后的复合培养基研究3L罐分批发酵的溶氧及分批-补料发酵中的诱导剂对重组大肠杆菌发酵生产α-CGT酶的影响,结果显示分批发酵中的大肠杆菌在30%DO下所得的胞外酶活最高,达到17.8 U/mL,分别为同期20%DO和40%DO水平下的1.7和1.2倍。分批-补料发酵中的大肠杆菌在诱导条件下的产酶状况比非诱导条件下好,其中采用IPTG诱导时,发酵30h的胞外酶活达49.7 U/mL,是非诱导条件下的1.6倍；采用乳糖诱导时,发酵27h的胞外酶活达44.0 U/mL,是非诱导条件下的1.4倍。3、在3L罐中研究非诱导条件下合成培养基对重组大肠杆菌高密度发酵生产α-CGT酶的影响,结果显示合成培养基适合菌体的高密度生长,菌体OD600最高达到150.0,但菌体不产酶。为了诱导重组大肠杆菌表达异源蛋白,实验比较了不同诱导剂、诱导浓度和诱导时间对菌体高密度发酵生产α-CGT酶的影响,结果表明：1)在0.5 mM IPTG诱导下,菌体在诱导后1h立即开始自溶,胞外无酶活；在8.0 g/L/h乳糖诱导下,菌体在诱导后4h内继续以指数形式增长,菌体OD600最高为71.1,胞外酶活最高达10.0 U/mL。2)菌体在0.8 g/L/h乳糖诱导下的胞外酶活最高,发酵27h的胞外产量达46.44 U/mL,分别是0.4 g/L/h和8.0 g/L/h的1.8倍和4.6倍。3)重组大肠杆菌在OD600=50诱导所得的胞外酶活最高,分别为OD600=25和100诱导的5.5倍和66.3倍。4、在3L罐中研究补料液中的氮源以及诱导温度对重组大肠杆菌高密度发酵生产α-CGT酶的影响。结果显示：1)菌体在含有机氮源的补料液中发酵所得胞外酶活最高,为105.1 U/mL,是对照实验的2.3倍；在含无机氮源的补料液中发酵所得胞外酶活最低,为8.8 U/mL,仅为对照实验的19.0%。2)菌体在25℃诱导下发酵35h所得胞外酶活最高,达275.3 U/mL,是20℃和30℃诱导下5.1倍和3.6倍,该产量是目前所有报道胞外生产a-CGT酶的最高产量。