无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，又称为 B群链球菌(Group B streptococcus，GBS)，革兰氏阳性菌，可导致多种动物（水生动物、哺乳动物）患病及人类多种疾病。近年来，中国罗非鱼养殖主产区暴发了严重的无乳链球菌病，冲击了中国罗非鱼产业的发展，经济损失严重，阻碍了中国罗非鱼产业的健康发展。抗生素治疗罗非鱼无乳链球菌病是目前采用的主要方法，但是抗生素的不合理使用会增加病原的耐药性。疫苗因具有高效、安全、无残留等特点是预防罗非鱼无乳链球菌病的潜在有效手段之一，也是目前研究的热点。　　无乳链球菌表面免疫原性蛋白LrrG（Leucine-rich repeat protein from GBS）和Sip（Surface Immunogenic Protein）存在于各种血清型菌株中，高度保守，两者在抗罗非鱼无乳链球菌病方面均具有良好的免疫保护作用。有研究表明将两个或两个以上免疫原性基因融合，表达出的融合蛋白的免疫原性要优于单一蛋白。本研究试图将罗非鱼无乳链球菌的两个免疫原性基因LrrG和Sip融合后表达，获得LrrG-Sip融合蛋白，探讨该融合蛋白能否提供更好的免疫保护率。本研究首先根据序列分析，设计引物，扩增罗非鱼无乳链球菌的表面蛋白LrrG和Sip基因，然后利用双酶切技术将基因LrrG和Sip串联，中间添加具有生物学保护功能的疏水性多肽接头(Gly4Ser)3 linker序列，最后插入到原核表达载体pCold II中，构建原核表达载体pCold II-LrrG-Sip，转入感受态细胞BL21(DE3)，经过表达条件优化，成功诱导表达获得了LrrG-Sip融合蛋白，并将纯化的融合蛋白注射免疫尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）。主要研究内容与结论如下：　　1．罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合基因原核表达载体的构建及表达　　提取无乳链球菌基因组DNA，查找目的基因LrrG、Sip全基因序列，相关软件分析目的基因序列，结合原核表达质粒pColdⅡ酶切位点和基因序列酶切位点设计引物。为使融合蛋白的生物活性尽量接近天然蛋白，在Sip上游引物中添加具有生物学保护功能的疏水性多肽接头(Gly4Ser)3 linker序列。鉴于LrrG、Sip基因较大，通过重叠延伸PCR技术容易带来碱基突变，本研究采用基因拼接技术中的双酶切法分两步逐个将Sip和LrrG基因插入pCold II载体中，构建原核表达载体pColdII-LrrG-Sip。将成功构建的融合基因原核表达载体转化感受态细胞BL21(DE3)，SDS-PAGE显示该融合蛋白以可溶和包涵体2种形式存在。通过控制变量的方法分别研究了IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对融合蛋白表达的影响，进行了诱导表达条件的优化。结果显示在15℃、IPTG0.5mmol·L-1、诱导9h的条件下，目的蛋白呈可溶状态的表达量最高。经His Bind亲和柱纯化、Western Blot检测结果显示LrrG-Sip融合蛋白大小与预测一致（162kDa）。说明成功构建了融合基因，获得了LrrG-Sip融合蛋白，为下一步罗非鱼源无乳链球菌LrrG-Sip融合蛋白的免疫原性研究奠定了基础。　　2?罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合蛋白免疫原性研究　　为探究无乳链球菌LrrG和表面免疫原性蛋白Sip串联表达的LrrG-Sip重组融合蛋白的免疫原性，本研究将原核表达的LrrG–Sip重组融合蛋白分别以0.5μg/g(R1组)、1.0μg/g(R2组)和1.5μg/g(R3组)每尾200μL腹腔注射免疫尼罗罗非鱼，同时分别注射等同体积的1.0μg/g Sip蛋白（S组）、1.0μg/gLrrG蛋白（L组）以及PBS（P组）作为对照，所有鱼体免疫两周后进行无乳链球菌人工攻毒，攻毒剂量为其半致死浓度LD50（4.0×108cfu/mL）。结果显示R1组对尼罗罗非鱼的相对免疫保护率最高，达89.14％；且免疫后14d和28d，该组鱼体血清抗体OD值分别达0.63和0.64，均显著高于单一蛋白组（S和L）和PBS组（P<0.05）；R1组鱼体血清过氧化物酶（POD）和碱性磷酸酶活性（AKP）在上述两个时间点也显著高于其它组（P<0.05）；但溶菌酶（LZM）和总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性与其它组之间差异不显著（P>0.05）。初步表明LrrG-Sip重组融合蛋白具有良好的免疫原性，其免疫原性明显优于单个蛋白，且能有效减少免疫剂量。