色氨酸代谢在禾谷镰刀菌生长发育与产毒致病过程中的功能研究及应用

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禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)能引起小麦赤霉病((Fusarium head blight,FHB),造成小麦减产。镰刀菌毒素是禾谷镰刀菌侵染过程中产生的多种有毒有害次生代谢产物,如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)、雪腐镰刀菌烯醇(Nivalenol,NIV)等,威胁着粮食安全与人畜健康。本论文以禾谷镰刀菌中一组编码色氨酸(Tryptophan,Trp)代谢首步限速酶吲哚胺-2,3-双加氧酶(Indoleamine-2,3-dioxygenase,Ido)的多拷贝基因FgIDOA/B/C为研究对象,探究了Trp代谢(初生代谢)在禾谷镰刀菌生长发育及产毒致病过程中的作用,以及多拷贝基因FgIDOA/B/C的生物学功能与分化。Trp代谢支路包括犬尿氨酸途径(Kynurenine Pathway,KP)、褪黑素(色胺)途径(Melation Pathway,MP)以及吲哚途径(Indole Pathway,IP)三种。KP为必须辅酶因子NAD+合成提供底物烟酸单核苷酸,MP消耗Trp为神经活性物质5-羟色胺合成提供底物褪黑素,IP则是通过Trp代谢合成吲哚、吲哚-3-醛酸等活性物质。本论文主要研究结果如下:(1)遗传进化分析表明,Ido在物种中分布广泛,禾谷镰刀菌中的FgIdo A和FgIdo B与藤仓镰刀菌、轮枝镰刀菌、曲霉属真菌、酿酒酵母以及部分细菌等具有较高的同源性,而FgIdo C与上述物种具有较远的亲缘关系,但与少数担子菌门真菌、无脊椎动物亲缘关系更近;(2)通过双接头PCR和酵母间隙修复策略构建了禾谷镰刀菌中3个同源基因FgIDOA/B/C的单、双、三缺失突变体、FgIDOA基因互补突变体以及FgIDOB/C基因过表达突变体,并测定了上述突变体的系列生长表型。与野生型菌株PH-1相比,FgIDOB/C基因相关缺失突变体的生长发育与产毒致病无明显差异,而FgIDOA基因缺失突变体菌丝营养生长表现出不同程度的NAD+缺陷,且分生孢子形态发生改变、孢子萌发率显著降低、DON产量显著下降及在扬花期麦穗上的致病力显著降低。外源添加NAD+及其他中间产物,回补全长FgIDOA基因可使FgIDOA缺失突变体的表型缺陷回复;(3)通过采用靶向及非靶向代谢分析比较了野生型菌株与FgIDOA/B/C基因系列突变体中不同Trp代谢通路中相关代谢物的含量变化。FgIDOs功能缺陷后Trp代谢通路走向发生改变,FgIDOA基因缺失后KP相关代谢物合成量显著下降,而FgIDOB基因缺失后IP、MP相关代谢物含量显著上调;(4)RT-PCR测定野生型菌株PH-1与不同突变体在Trp处理前后FgIDOA/B/C基因表达水平,结果表明,ΔFgIDOA、ΔFgIDOAB和ΔFgIDOAC中其他FgIDO基因的表达水平上升。此外,过表达突变体OE::FgIDOBΔFgIDOA、OE::FgIDOCΔFgIDOA的NAD+生长缺陷得以恢复,可以在不含NAD+的FMM培养基上生长。以上表明禾谷镰刀菌中3个同源的FgIDOA/B/C在Trp代谢经由KP为NAD+生物合成提供原料的反应中,存在基因转录水平上的功能互补。综上所述,本论文解析了禾谷镰刀菌中3个同源的FgIDOA/B/C多拷贝基因参与Trp代谢、生长发育与产毒致病过程中的生物学功能及分化,阐明初生代谢过程(Trp代谢)对病原菌生长发育及次生代谢(毒素合成等)过程的调节作用,同时鉴定了重要产毒致病相关基因,为新型药剂研发提供了潜在靶标,也为赤霉病持续防控和毒素污染综合治理提供了理论依据。
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