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互花米草,作为江苏沿海入侵植物,具有重要的科学研究价值,团队成员多年来致力于江苏省盐城市大丰港沿海滩涂盐碱地互花米草的资源化和产业化利用的研究。本论文主要从分子生物学角度对侵染互花米草的海洋真菌及其病毒进行了系列的研究,这也是对互花米草项目相关研究的一个探索和补充。 本研究首先从该地区的互花米草中分离得到22种真菌,通过dsRNA抽提发现YDC07真菌有dsRNA存在。根据真菌YDC07的培养性状、光学显微镜观察以及rRNA-ITS区序列同源性分析发现该菌与海洋真菌互花米草比尔格纳(Buergenerulaspartinae)特征相似、同源关系极其相近,并且与报道的该真菌在互花米草上的侵染部位一致,于是推测该真菌菌株为子囊菌门、巨座壳科、中国新纪录菌属比尔格纳属、互花米草比尔格纳菌中一员,并命名为B.spartinaeYDC07(GenBank登录号:KJ459363)。同时发现该真菌可以侵染互花米草秸秆,并使其干物质量逐渐降低。 采用经改进的的单引物扩增法(ModifiedSinglePrimeAmplificationTechnique,M-SPAT)对抽提到的dsRNA进行cDNA克隆,并获得全长cDNA克隆产物,cDNA克隆产物的测序结果显示该片段序列全长为2735bp。 经软件查找,发现该dsRNA序列含有多个不连续的开放型阅读框(ORE框),根据部分病毒(如线粒体病毒)的密码子UGA不是作为终止密码子起作用,而是编码色氨酸(Trp)的性质,推断该dsRNA序列有一个2430bp的大的ORF框。该保守的ORF框区域经Blast比对发现与线粒体病毒家族的依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)序列(810aa,89.1kDa)同源,相似性为27%~43%。进一步通过生物信息学软件进行序列相关性质的分析发现:该病毒序列特点和之前报道的线粒体病毒特征一致,都有六个相同的Motif保守区域(MotifⅠ-Ⅵ);RdRp的系统进化树显示,该病毒和其他11个线粒体病毒分为一簇,并且和Cryphonectriacubensismitovirus2a,Cryphonectriacubensismitovirus2b,Cryphonectriacubensismitovirus2c及Cryphonectriaparasiticamitovirus1-NB631的进化关系最近;该病毒5-UTR和3-UTR二级结构显示其都能折叠成茎环结构,并且自由能△G也比较低,这种稳定结构有利于病毒复制过程中RdRp的识别,也是线粒体病毒的一个特点,由此推断该病毒属于裸露病毒科(Narnaviridae)线粒体病毒属(Mitovirus)病毒。病毒基因组RT-PCR和Northernblot验证结果证实得到的病毒序列确实来自于互花米草比尔格纳菌YDC07菌株中抽提到的病毒条带。 综上所述,本研究首次在国内报道了一株侵染互花米草的海洋真菌及其线粒体病毒,该真菌为互花米草比尔格纳菌中的一种,同时可以侵染互花米草秸秆并使其干物质量逐渐减轻。另外,对该真菌中的病毒序列进行分析,确定其为线粒体病毒属家族成员,进而命名为B.spartinaemitovirus1(GenBank登录号:KJ485703),并对该病毒序列的来源进行了验证。