研究背景CD74又称为Ii,是一个多功能的细胞因子。作为MHC class Ⅱ的恒定链,CD74参与MHC class Ⅱ所介导的抗原呈递过程,不仅在内质网中辅助MHC class Ⅱ的正确折叠,调控MHC class Ⅱ出内质网,也能调控MHC class Ⅱ从高尔基体转运到抗原加工小室。作为MIF的受体,CD74不仅参与MIF对炎症因子的调控,也参与MIF所介导的抑制细胞凋亡,促进存活过程。此外,CD74也与多种人类疾病相关,其中包括自身免疫疾病,如系统性红斑狼疮,也包括动脉粥样硬化、阿尔茨海默病以及癌症。研究表明CD74在包括乳腺癌在内的多种肿瘤中过表达,并且与透明细胞肾细胞癌、胃癌和胰腺癌的侵袭有关。近期研究表明CD74在乳腺癌中过表达,并且与乳腺癌的淋巴结转移和三阴性乳腺癌呈线性相关,但尚未见相关分子机制报道。CD44是透明质酸受体,当透明质酸与CD44结合后可以促进CD44直接或通过接头蛋白与受体酪氨酸激酶相互作用,并激活下游信号通路,如PI3K-AKT信号通路和MAPK级联反应,主要参与调控细胞凋亡、存活和增殖等,并与肿瘤细胞的抗药性相关。CD44还能够通过接头蛋白与Ras超家族的小GTPase蛋白相互作用,促进RHOA、RAC等RHO GTPases的活性,参与调控细胞骨架的组装或重排。肿瘤细胞的干性也与CD44相关,高表达CD44的人类肿瘤细胞具有恶性程度高以及耐药性的特点,乳腺癌细胞中所分离出来的CD44+ CD24-抗原表型的细胞亚群所表现出来的干细胞特性通过上调EMT相关的细胞因子(如TWIST、SNAIL等)来实现。RHO GTPases属于小GTPase Ras超家族的成员,根据氨基酸序列的相似性划分为8个亚家族,其中RHOA、RAC1和CDC42获得广泛研究。RHOA通过其下游效应蛋白ROCK调控肌球蛋白轻链的磷酸化,磷酸化的肌球蛋白轻链可以增强肌球蛋白ATPase的活性来诱导肌球蛋白收缩。另外,RHOA也可以通过ROCK调控下游LIMK的磷酸化,激活的LIMK对其主要下游底物CFL进行磷酸化,调控细胞骨架组装或重排。PAK是RAC1和CDC42的共同下游效应蛋白,激活的PAK通过LIMK调控CFL的磷酸化,并影响细胞骨架的稳定性。此外,RAC1的效应蛋白WAVE可以对ARP2/3进行调控,促进actin的聚合和actin骨架形成。CDC42则通过WASP来调控ARP2/3介导的actin骨架的组装。目前已经发现RHO GTPases在多种人类肿瘤中过表达,并且与肿瘤的侵袭和转移相关。CFL是一个actin结合蛋白,具有两种形式,无切割活性的Ser3位点磷酸化形式和具有活性的非磷酸化形式。活化的CFL倾向于与F-actin中负极端的GDP·actin结合,并对F-actin切割,促进F-actin解聚,产生大量的G-actin单体以及游离的F-actin末端,而G-actin会在结合GTP后被添加到正在延伸的F-actin中,促进F-actin聚合,所产生的游离F-actin末端则会被ARP2/3复合物再次利用,促进F-actin的成核、延伸或actin网状分支的形成。因此CFL对细胞骨架具有聚合和解聚的双重调控作用。本研究在于明确CD74是否通过调控细胞骨架相关蛋白,影响乳腺癌细胞的侵袭和转移。研究方法1.通过免疫组化和临床数据分析,检测CD74在乳腺癌细胞中的分布以及与乳腺癌的关系。2.细胞侵袭实验和细胞迁移实验检测CD74敲低后对乳腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响。3.TRITC-phalloidin对F-actin进行染色,激光共聚焦显微镜(CLSM)下检测CD74敲低或过表达时对乳腺癌细胞细胞突出形成的影响。4.抑制或过表达CD74后,western blot检测细胞骨架调控相关蛋白的变化。5.免疫荧光和免疫共沉淀实验检测CD74与CD44的相互作用。6.CD74或/和CD44敲低,western blot检测CD74和CD44对CFL1磷酸化水平的影响。7.CD74 或/和 CD44 敲低,TRITC-phalloidin 对 F-actin 进行染色,CLSM 下检测乳腺癌细胞细胞突出形成的变化。8.过表达CD74的情况下敲低CD44,western blot检测CD74与CD44的调控关系。9.敲低CD74的情况下加入MG132,western blot检测CD74对CD44稳定性的影响。10.利用特异siRNA或抑制剂抑制MIF,western blot检测MIF对CFL1磷酸化水平的影响。11.免疫共沉淀实验检测MIF过表达减弱CD74与CD44的结合。12.乳腺癌细胞中转染RHO GTPase家族成员相关质粒,western blot检测RHO GTPase家族成员对CD74介导的CFL1磷酸化影响。13.细胞迁移实验检测RHOA对CD74介导的乳腺癌细胞迁移能力的影响。14.利用慢病毒包装体系制备病毒,并感染MDA-MB-231细胞,筛选获得CD74稳定敲低细胞系。15.裸鼠移植瘤实验检测CD74对肿瘤形成和转移的影响。实验结果1.BIDC中CD74在质膜和细胞质中的表达水平普遍偏高,CD74与乳腺癌以及乳腺癌的临床阶段和淋巴结转移关系密切。2.在MDA-MB-231细胞中利用含CD74 shRNA的质粒敲低CD74,细胞侵袭实验表明敲低CD74可以抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力。3.在MDA-MB-231细胞中利用含CD74 shRNA的质粒敲低CD74,细胞划痕实验表明敲低CD74可以抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力。4.MDA-MB-231 细胞(或 T47D 细胞)中敲低 CD74,TRITC-phalloidin 对 F-actin进行染色,CLSM下观察细胞突出的形成,结果表明CD74敲低后细胞突出的形成受到抑制。5.在MCF-7细胞中过表达CD74,TRITC-phalloidin对F-actin进行染色,CLSM下观察细胞突出的形成,结果表明过表达CD74可以促进MCF-7细胞细胞突出的形成。6.利用含CD74 shRNA的质粒在CD74高表达的MDA-MB-231细胞中敲低CD74,检测到与细胞骨架调控相关的ROCK1和p-CFL1蛋白水平的下调。T47D细胞中重复上述实验,获得了一致结果。7.利用pcDNA3.1-CD74质粒在低表达CD74的MCF-7细胞中过表达CD74,检测到与细胞骨架调控相关的ROCK1和p-CFL1蛋白水平的上调。HCC1806细胞中重复上述实验,获得了一致结果。8.免疫荧光实验表明,MDA-MB-231和T47D细胞中AlexaFluor 568染料标记的CD74与AlexaFluor488染料标记的CD44分别存在共定位。9.在 MDA-MB-231 细胞(或 T47D 细胞)中过表达 pcDNA3.1-Flag-CD74,免疫共沉淀实验表明CD74和CD44存在相互作用。10.MDA-MB-231细胞中利用细胞内源的CD44进行免疫共沉淀实验同样证实CD74和CD44存在相互作用。11.利用 CD44 特异的 siRNA 在 MDA-MB-231 细胞中敲低 CD44,western blot检测到CD74、ROCK1和p-CFL1蛋白水平的下调。T47D细胞中重复上述实验获得了一致结果。12.MDA-MB-231 细胞中利用含 CD74 shRNA 的质粒(pLT-shCD74#1 和pLT-shCD74#2)敲低 CD74 或/和利用 CD44 特异的 siRNA 敲低 CD44,western blot检测到CD74或/和CD44的敲低会引起CFL1磷酸化水平的下调。T47D细胞中重复上述实验获得了一致结果。13.MDA-MB-231 细胞中利用含 CD74 shRNA 的质粒(pLT-shCD74#1和pLT-shCD74#2)敲低CD74或/和利用CD44特异的siRNA敲低CD44,TRITC-phalloidin对F-actin进行染色,CLSM下观察细胞突出的形成,结果表明敲低CD74或/和CD44可以抑制MDA-MB-231细胞细胞突出的形成。T47D细胞中重复上述实验获得了一致结果。14.在MDA-MB-231细胞(或T47D细胞)中利用pcDNA3.1-CD74质粒过表达CD74并利用CD44特异的siRNA敲低CD44,western blot结果表明CD44的下调能够抑制由于CD74过表达所引起的CFL1磷酸化水平的上调。15.MDA-MB-231细胞中敲低CD74能够引起CD44蛋白水平的下调,而当加入不同浓度的MG132后CD44的下调受到抑制。16.利用MIF特异的siRNA或MIF特异性的抑制剂ISO-1抑制MIF,以及通过pcDNA3.1-MIF质粒过表达MIF,结果表明MIF蛋白水平与CFL1的磷酸化水平呈负相关。17.HEK 293FT 细胞中同时过表达 pcDNA3.1-Flag-CD74 和 pcDNA3.1-MIF,免疫共沉淀实验结果表明MIF过表达的情况下,CD74与CD44的相互作用减弱。18.MCF-7细胞中CD74过表达引起的CFL1磷酸化水平上调可以被RHO GD1或RHOAN19所抑制:MDA-MB-231细胞中CD74敲低所引起的CFL1磷酸化水平的下调可以被RHOAL63所抑制。19.MDA-MB-231细胞中敲低CD74并过表达RHOAL63,细胞迁移实验表明RHOAL63能够抑制CD74敲低引起的细胞迁移能力的下调。MCF-7细胞中过表达CD74和RHOAN19,细胞迁移实验表明RHOAN19能够抑制CD74过表达引起的细胞迁移能力的上调,免疫荧光实验表明RHOAN19能够抑制CD74过表达条件下细胞突出的形成。20.裸鼠分为3组,分别进行腹部皮下注射MDA-MB-231pLT-shCTRL,MDA-MB-231 pLT-shCD74#1 或 MDA-MB-231 pLT-shCD74#2 细胞,成瘤实验表明CD74的敲低能够抑制肿瘤的生长,且MDA-MB-231 pLT-shCTRL对照细胞注射组裸鼠发现一例肝转移。21.裸鼠分为3组,分别进行尾静脉注射MDA-MB-231 pLT-shCTRL,MDA-MB-231 pLT-shCD74#1 或 MDA-MB-231 pLT-shCD74#2 细胞,MDA-MB-231 pLT-shCTRL对照细胞注射组裸鼠发现2例肺出现转移结节。结论1.CD74与乳腺癌以及乳腺癌的临床阶段和淋巴结转移之间关系密切。2.CD74敲低能够抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭能力。3.CD74的表达水平与细胞突出的形成正相关。4.CFL1的磷酸化水平与CD74的表达呈正相关。5.乳腺癌细胞中CD74与CD44存在共定位。6.CD74和CD44共同调控CFL1的磷酸化水平和细胞突出的形成,并且CD74位于CD44的上游。7.CD74可能通过抑制CD44蛋白酶体途径的降解,促进CD44的稳定性。8.乳腺癌细胞中,MIF过表达减弱CD74与CD44的结合,从而抑制CD74对CFL1磷酸化水平的调控。9.RHOA介导CD74对CFL1磷酸化水平的调控和细胞突出的形成。10.抑制CD74能够抑制乳腺癌肿瘤的形成。11.抑制CD74能够抑制乳腺癌细胞的肺转移。综合以上结果,我们的研究证实:乳腺癌细胞中,CD74与肿瘤的迁移、侵袭以及细胞突出的形成相关,CD74与CD44相互作用通过RHOA介导的CFL1磷酸化促进肿瘤的形成和转移。另外,我们的研究结果也表明CD74可能通过抑制CD44蛋白酶体途径的降解来提高CD44的稳定性:MIF过表达减弱CD74与CD44的结合,从而抑制CD74所介导的CFL1磷酸化信号通路。