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糖基化是重要的蛋白质修饰方式之一,不仅存在于真核生物细胞中,还在部分古生菌和细菌中被发现。N-糖基化(N-linked glycosylation)是蛋白糖基化的一种主要形式,起始于内质网(ER)中。真核细胞ER内N-糖基化过程包括ER膜上多萜醇寡糖前体(Dolichol-linked oligosaccharides:DLO)的组装和将寡糖转移到ER腔内的新生多肽的特定天冬酰胺残基上。其中DLO的组装发生在ER膜上并且由特定的糖基转移酶(Alg蛋白)催化完成,此过程相对保守。如果人体内Alg蛋白发生异常则会导致先天性糖基化疾病(Congenital disorders of glycosylation:CDG)。以往对于DLO合成路径中ER膜上胞质侧Alg蛋白的研究结果显示,这些酶以两个酶复合体的形式存在:即Alg7、Alg13、Alg14复合物和Alg1、Alg2、Alg11复合物,这表明DLO路径中的糖基转移酶倾向于以酶复合体的形式存在;而ER腔内的Alg3、Alg9、Alg12的糖基供体相同,存在同样以酶复合体的形式存在的可能性。本研究探索ER膜内侧的3个甘露糖转移酶Alg3、Alg9、Alg12的相互作用,证明了Alg3、Alg9、Alg12同样以复合物形式存在;并对Alg3蛋白突变导致的ALG3-CDG进行了体外定量活性测试的研究。主要研究包括:1)分别构建了共表达酵母来源的Alg3和Alg9,Alg3和Alg12,Alg9和Alg12的3种酿酒酵母菌株,使相应的两个蛋白在酿酒酵母W303a中共表达后提取酵母膜蛋白,Anti-FLAG亲和琼脂糖珠吸附蛋白,最后做Western blot分析。实验结果表明,Alg3和Alg9,Alg3和Alg12,Alg9和Alg12蛋白两两之间存在相互作用。随后在大肠杆菌体系(E.coli)构建了酵母来源的Mistic-Alg3、Alg9、Alg12甘露糖转移酶共表达的菌株,提取E.coli菌膜成分,用Western blot分析检测到Mistic-Alg3、Alg9、Alg12甘露糖转移酶均有表达后,进行免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)实验和Western blot分析。结果表明,在共表达酶的E.coli中,Mistic-Alg3、Alg9、Alg12以酶复合体的形式存在。本研究是首次证明这3个糖基转移酶之间的相互作用。2)在体外进行了上述E.coli共表达酶的活性分析:以PPGn2-M5为底物,含有Mistic-Alg3、Alg9、Alg12的E.coli菌膜成分催化合成PPGn2-M9。在与单独表达Mistic-Alg3、Alg9、Alg12的催化反应对比中发现,共表达的酶比单独表达的Mistic-Alg3、Alg9、Alg12具有更高的催化效率。3)在E.coli中表达了6个与ALG3-CDG相关的酵母保守性Mistic-Alg3突变蛋白(突变位点分别为:I70T、Y72R、G98R、L157K、R171Q和M221T),通过液质联用(Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS)技术定量检测上述突变蛋白的酶活。结果显示ALG3-CDG相对应的酿酒酵母突变蛋白的酶活下降程度与报道的CDG疾病的严重程度具有一定的相关性。