黄精为百合科植物黄精Polygonatum sibiricum Red.、多花黄精P.cyrtonema Hua或滇黄精P.kingianum的干燥根茎,是我国的传统中药。生黄精具有麻舌感,对咽喉有较强刺激性,皮肤与生黄精或其汁液接触后,会具瘙痒感,久闻其味,有刺目之感。古人采用“九蒸九制”“酒黄精”等方法加工黄精,以去除刺激性和副作用,增加其补益作用,但工艺繁琐,耗能且费时、费力。本实验将微生物固态发酵技术引入黄精的加工中,可以有效去除黄精的麻味和刺激性,还能简化加工工艺,节约能耗。固态发酵后,生黄精麻舌感消失,香气增加,为探究其性味变化的物质基础,本实验采用SPME-GC-MS、TLC、HPLC等方法对发酵黄精的挥发性成分和小分子化学成分进行研究,通过对多糖成分的提取、分离和纯化比较发酵前后黄精多糖的含量及组分、官能团差异,并通过体内、体外实验,评价了固态发酵后的黄精多糖抗氧化和增强免疫的药理活性。本课题研究为黄精的产地加工提供了一种新型的加工方法,可以有效去除生黄精的刺激性,且简便,省时省工。在兽医临床抗生素被严格控制的背景下,为兽医临床提供了一种具有抗氧化应激和增强免疫作用的新天然药物,为黄精药材在兽医临床的综合开发应用奠定基础。1黄精的固态发酵工艺研究分别用枯草芽孢杆菌和啤酒酵母菌对黄精进行固态发酵,考察发酵时间、用菌量、药材含水量对黄精固态发酵的影响。以多糖和浸出物含量各占50%的综合评分为评价指标,确定各单因素的最优水平,并以同种评价标准进行响应面优化。结果表明,拟合方程各因素拟合度良好,枯草芽孢杆菌最佳发酵工艺为:发酵时间41 h,用菌量22%,药材含水量40%;啤酒酵母菌最佳发酵工艺为:发酵时间47 h,用菌量16%,药材含水量29%。2固态发酵黄精的化学成分变化研究2.1挥发性成分的变化分析采用SPME-GC-MS对固态发酵前后的黄精挥发性成分进行检测和比较。结果表明:2个样品共检测出98种挥发性成分,其中生黄精91种,枯草芽孢杆菌发酵黄精77种。生黄精与发酵黄精二者共有成分70种。生黄精独有成分21种,发酵黄精独有成分7种。挥发性成分的类别主要有烃类、醛类、酸类、杂环类、酯类、酮类、酚类、醇类。发酵后,在含量高于10%的成分中,酸类成分显著增加,醛类成分减少,其他成分无明显变化。2.2小分子化合物化学成分变化分析薄层色谱结果表明:两种发酵黄精与生黄精对照药材在相同位置具有相同的斑点,提示发酵黄精具有和对照药材非常相似的化学成分。高效液相色谱结果显示:生黄精经过发酵后,小分子化合物发生了组分和含量变化,增加的化学成分的峰号为:1号（7.7min）、2号（8.7min）、3号（9.5min）、4号（12.1min）和5号峰（29.5min）。两种发酵品6号峰（62.5min）的峰面积明显大于生黄精。2.3多糖的提取、分离、纯化和组分研究通过水提醇沉法对发酵前后的黄精粗多糖加以提取,以苯酚硫酸法、考马斯亮蓝法和福林酚法测定粗多糖的多糖、蛋白和多酚含量。结果显示,生黄精、枯草芽孢杆菌发酵黄精、啤酒酵母菌发酵黄精的粗多糖的得率分别为15.57%,12.57%,13.22%;颜色分别成:黄色、棕色、棕黑色;其中多糖含量分别为61.18%、56.41%、50.04%;多酚含量分别为0.15%、0.67%、0.68%;蛋白质含量分别为0.24%、0.42%、0.28%。采用DEAE-琼脂糖凝胶柱对粗多糖进行分离、纯化,采用红外光谱对纯化后的多糖进行官能团解析。3种样品分别纯化得到中性多糖和酸性多糖,生黄精、枯草芽孢杆菌发酵黄精、啤酒酵母菌发酵黄精的中性多糖分别命名为S-NP、K-NP、P-NP;酸性多糖分别命名为S-AP、K-AP、P-AP。生黄精以中性多糖为主,占68.48%,枯草芽孢杆菌发酵黄精以中性多糖为主,占64.10%,啤酒酵母菌发酵黄精中性多糖和酸性多糖占比相差较小,中性多糖占47.80%,酸性多糖占52.20%。三种中性糖都含有O-H、C-H、C=O和C-O 4种多糖特征性官能团,S-NP在1128.13m-1处有C-O-C的伸缩振动峰,在934.63 cm-1处有葡萄糖的特征吸收峰,K-NP、P-NP无此吸收峰。K-NP、P-NP在889.90、889.20 cm-1处有吸收峰,是β-糖苷键的特征吸收峰,S-NP无此吸收峰。三种酸性糖都含有O-H、C-H、C=O和C-O 4种多糖特征性官能团,S-AP在1115.31 cm-1和1148.93cm-1处有C-O-C的伸缩振动峰,其吸收峰是由吡喃糖环内酯和羟基的吸收产生;在954.25 cm-1处有葡萄糖的特征吸收峰,K-AP、P-AP无此吸收峰。3固态发酵后黄精多糖的抗氧化和免疫调节活性对比研究3.1黄精多糖的抗氧化活性比较3.1.1体外抗氧化活性:通过测定DPPH、ABTS、OH自由基、总还原能力来评价发酵前后纯化多糖的体外抗氧化活性。结果表明:黄精发酵后,酸性多糖对DPPH、ABTS自由基的清除力及总还原力均增强,当质量浓度为10 mg/m L时,PAP的清除率最高。经过发酵,中性多糖的DPPH·清除力在一定程度上降低,对·OH清除能力及总还原能力增强,对ABTS·的清除率在发酵前后无明显变化。3.1.2体内抗氧化活性:采用皮下注射D-半乳糖建立小鼠衰老模型,研究不同剂量发酵前后多糖对小鼠血清和肠道氧化指标的影响。结果表明:（1）对血清氧化指标的作用:模型组血清MDA和PCO含量较空白组极显著升高。与模型组相比,给药组中除KM组外,其余各组MDA、PCO含量均极显著降低,其中SM组的MDA含量最低,SL组降低PCO作用最为显著。与空白组相比,模型组SOD、CAT含量显著降低,GSH-Px、T-AOC的含量极显著降低。相较模型组,给药组中KM、KH组SOD水平极显著上升;除SH组无显著性外,其余各组GSH-Px含量均极显著性上升;KL组CAT含量极显著上升,其余各组不显著;除SL组T-AOC的含量显著上升外,其余各组均极显著上升。其中,KH组提升血清T-AOC、SOD、GSH-Px的作用最为显著,KL组提升CAT作用最强。（2）对肠道抗氧化指标的影响:与空白组相比,模型组的空肠MDA、PCO含量显著升高;结肠PCO含量极显著升高,MDA含量升高但不显著。相比模型组,给药组中KL组的空肠MDA含量显著降低,KL、KM、KH组结肠MDA含量极显著降低;给药组空肠PCO含量均显著降低,除SM组外,给药组结肠PCO含量也显著降低。其中KL组空肠MDA含量最低,SH组降低空肠PCO作用最为显著;KM组结肠MDA含量最低,KH组降低结肠PCO作用最为显著。与空白组相比,模型组的肠道SOD、GSH-Px、CAT和T-AOC含量显著降低,与模型组相比,给药组均以KH组提升结肠、空肠T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT的作用最为显著。3.2黄精多糖对免疫抑制小鼠免疫调节作用比较采用腹腔注射环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型,研究不同剂量发酵前后多糖对小鼠脏器指数、血清免疫细胞因子和肠道的影响,评价黄精多糖对小鼠免疫调节的作用。结果表明:（1）对脏器指数的影响:模型组的胸腺、脾脏和肝脏指数相较空白组均显著下降。相较模型组,给药组的胸腺、脾脏和肝脏指数增加。以KL组的胸腺指数、脾脏指数增加最为显著（P＜0.01）。（2）对血清细胞因子的影响:相较空白组,模型组的血清TNF-α、IFN-γ、IL-2、Ig G含量显著下降（P＜0.05）,相比模型组,给药组增加了血清TNF-α、IFN-γ、IL-2、Ig G含量。其中SM组对TNF-α的增加效果最为显著,KH组对IL-2、Ig G含量增加最为显著（P＜0.01）。（3）对肠道粘膜屏障的影响:模型组LPS含量相较空白组极显著上升,给药组的LPS含量相比模型组均极显著降低,其中以KM组的下调效果最为显著。相比空白组,环磷酰胺模型组的空肠紧密连接蛋白Occludin值极显著下降（P＜0.01）,结肠下降但无显著差异。与模型组相比,给药组的空肠Occludin值除SM组外,均显著上升;结肠KM、KH组Occludin值显著上升。（4）对肠道免疫的影响:相较空白组,模型组的空肠、结肠SIg A含量极显著下降,相较模型组,给药组的空肠SIg A含量上升,KL组有极显著性差异,KH组有显著差异;结肠SIg A含量SL、KM、KH组显著上升。（5）对肠道菌群的影响:相较空白组,模型组的双歧杆菌、乳酸杆菌数量极显著减少,大肠杆菌、肠杆菌的数量极显著增多。相较模型组,给药组能够有地效减少有害菌数量,增加有益菌的数量:其中SH、KL组的双歧杆菌数极显著增加,KL、KH组的乳酸杆菌数量极显著增加,KH组的肠杆菌数量极显著减少,SL、SM、SH、KL、KM组的大肠杆菌数量极显著减少。相较空白组,模型组盲肠内容物p H值极显著升高,相较模型组,给药组盲肠内容物p H都有所降低,KM组有极显著性差异。