【摘 要】
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麦麸含有丰富的木聚糖半纤维素,其结构的复杂性是高效生产低聚木糖（XoS）和阿魏酸（FA）的一个重要瓶颈。要想实现木聚糖的有效降解,需多种木聚糖降解酶的协同作用。为了提高产酶水平,增强多酶的催化效率,获得高产量的XOS和FA,本文利用微生物共培养一步生产木聚糖酶（XynB-XBD6）、阿拉伯呋喃糖苷酶（Ara-XBD6）和阿魏酸酯酶（Fae-XBD6）,探究了它们降解麦麸的协同作用,优化了产酶和酶解
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麦麸含有丰富的木聚糖半纤维素,其结构的复杂性是高效生产低聚木糖（XoS）和阿魏酸（FA）的一个重要瓶颈。要想实现木聚糖的有效降解,需多种木聚糖降解酶的协同作用。为了提高产酶水平,增强多酶的催化效率,获得高产量的XOS和FA,本文利用微生物共培养一步生产木聚糖酶（XynB-XBD6）、阿拉伯呋喃糖苷酶（Ara-XBD6）和阿魏酸酯酶（Fae-XBD6）,探究了它们降解麦麸的协同作用,优化了产酶和酶解条件,分析了酶解产物的产量和氧化还原能力以及麦麸的理化性质。1、阿魏酸酯酶的表达及酶学特性分析从热纤梭菌Clostridium thermocellum中获得Fae基因片段,成功构建重组质粒pET-20b-Fae、pET-20b-Fae-XBD6 和 pET-28a-Fae-XBD6,发现 pET-20b 系列的表达载体更有利于Fae的表达。Fae-XBD6和Fae的最适反应pH均为6.5,最适温度分别为75和70℃,融合XBD后pH向碱性转移,温度的稳定性有所下降。Mg2+和Zn2+对Fae-XBD6的活性有微弱的促进作用,而Li+和Cu2+对其有抑制作用。Cu2+和Zn2+提高了 Fae的活性,而Mg2+和Zn2+对其有较弱的抑制作用。重组酶Fae和Fae-XBD6的底物特异性顺序均为EFA＞MFA＞DSWB,kcat/Km分别为0.11±0.002、0.21±0.006 s-1·mM-1。Fae-XBD6的kcat/Km是Fae的1.93倍,XBD6的融合使酶对底物的催化能力增大。2、重组半纤维素酶对麦麸降解的协同作用构 建 重 组 菌 E.coli BL21（DE3）/pET-20b-XynB-XBD6 和 E.coli BL21（DE3）/pET-20b-Ara-XBD6,XynB-XBD6、Ara-XBD6 的产酶水平和表达水平分别为2.14 U/mL和1.29 U/mg、3.22 U/mL和1.9 U/mg。探究三酶对麦麸的协同作用,结果表明 XynB-XBD6 和 Fae-XBD6（摩尔比 2:1）、XynB-XBD6 和 Ara-XBD6（摩尔比 2:1）、Ara-XBD6 和 Fae-XBD6（摩尔比 1:1）双酶组以及 XynB-XBD6、Ara-XBD6和Fae-XBD6（摩尔比2:1:1）三酶组中RS和FA的释放量相对较高,三酶对麦麸降解的协同度最高。总载酶量对RS和FA的释放量均有较大提高,但对协同度并无较明显的影响。3、微生物共培养的优化及重组半纤维素酶的共生产为了共生产XynB-XBD6、Ara-XBD6和Fae-XBD6以及提高产酶水平,将E.coli BL21（DE3）/pET-20b-XynB-XBD6、E.coli BL21（DE3）/pET-20b-Ara-XBD6、E.coli BL21（DE3）/pET-20b-Fae-XBD6在同一反应器中进行共培养,优化产酶条件,在诱导时机为OD600=4.0,诱导浓度为0.8 mM,诱导时间为8h,生产XynB、Ara、FAE分为 8.6 U/mL、2.16 U/mL、54.66 U/L。4、重组半纤维素酶水解麦麸的应用为了提高XynB-XBD6、Ara-XBD6和Fae-XBD6对麦麸的水解效率,优化酶解条件,最优反应条件为:加酶量为XynB-XBD6、Ara-XBD6和Fae-XBD6分别为171.8、36.8和1.2 U/g,温度为70℃,时间为4 h,pH为5.0,底物浓度为1/20 g/mL。在最佳条件下,三酶协同作用于麦麸,4h后RS、FA、木糖、木二糖、木三糖的释放量最高分别达到 124.67、9.93、31.3、387.2 和 11.26 mg/g,分别是 XynB-XBD6 酶解产物的2.19、3.21、1.41、6.06和2.89倍。三酶酶解产物的还原能力和DPPH自由基清除能力是XynB-XBD6酶解产物的2.25倍和1.32倍,氧化还原能力与酶解产物呈正相关。三酶处理后的麦麸,持水力大大提高,麦麸表面出现许多小而密的孔洞,麦麸结构由密质的交联结构变得疏松。
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