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第一部分PTD-BDNF对海马神经元兴奋性突触活动的作用目的:研究具有跨血脑屏障功能的PTD-BDNF融合蛋白对培养的大鼠海马神经元细胞自发电活动的影响。方法:无菌分离出生24h的Wistar大鼠海马神经元,以5~7×104·ml-1的终浓度接种,进行原代培养。培养8d~9d时将细胞随机分为对照组、BDNF组和PTD-BDNF组,后两组中分别加入终浓度1nmol·L-1的BDNF和PTD-BDNF,继续培养24h后进行全细胞膜片钳记录。将电压钳制在-70mV,记录神经元自发兴奋性突触后电流;在细胞外液中加入1μmol·L-1河豚毒素静置约10min,仍在-70mV钳制电位下记录微小兴奋性突触后电流。观察PTD-BDNF和BDNF对海马神经元突触电流的影响。结果:与对照组比较,BDNF与PTD-BDNF作用后均可明显增加海马神经元自发兴奋性突触后电流(sEPSC)和微小兴奋性突触后电流(mEPSC)的产生频率[sEPSC的频率:(1.4±0.5)vs(4.0±0.6),(3.9±0.5)Hz,均为P<0.01;mEPSC的频率:(4.2±1.0)vs(7.9±1.9),(7.6±1.8)Hz,均为P<0.01],并增加sEPSC的幅度但并不影响mEPSC的幅度[sEPSC的幅度:(415.7±48.0)vs(743.7±95.7),(693.7±99.9)pA,均为P<0.01;mEPSC的幅度:(34.7±4.7)vs(36.3±6.2),(36.2±4.4)pA,均为P>0.05]。BDNF组与PTD-BDNF两者之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:PTD-BDNF融合蛋白可以增强大鼠海马神经元兴奋性突触活动,说明PTD-BDNF与BDNF在对神经元突触传递的调节方面具有相似的电生理活性。第二部分PTD-BDNF对海马神经元钠、钾、钙离子通道的影响目的:记录大鼠海马神经元细胞电压依赖性钠、钾、钙离子通道电流,观察PTD-BDNF融合蛋白对培养的大鼠海马神经元细胞钠、钾、钙离子通道的影响。方法:海马神经元培养方法同前。在培养第8d~9d时将培养的海马神经元细胞随机分成PTD-BDNF组、BDNF组和对照组两组,PTD-BDNF组、BDNF组分别加入终浓度为1nmol·L-1的PTD-BDNF和BDNF,继续培养2~3天后与对照组同时进行全细胞膜片钳实验观察钠、钾、钙电流变化情况。应用全细胞膜片钳技术记录培养的海马神经元细胞电压依赖性钠、钾、钙通道电流。记录钠电流时,将细胞钳制在-100mV,给予-60~+10mV以10mV递增,时程为400ms的阶跃方波刺激;记录钙电流时,将细胞钳制在-80mV,给予-50~+20mV以10mV递增,时程为150ms的阶跃方波刺激;记录钾电流时,将细胞钳制在-100mV,给予-50~+20mV以10mV递增,时程为400ms的阶跃方波刺激。观察PTD-BDNF融合蛋白对离子通道电流的影响,分析离子通道特性的改变。结果:与对照组比较,PTD-BDNF、BDNF分别使培养的海马神经元钠通道电流强度峰值增加39.35%和41.99%(n=4,P<0.01),并使钠通道电流-电压关系曲线下移(n=4,P<0.01);PTD-BDNF、BDNF分别使培养的海马神经元钙通道电流强度峰值增加39.20%和38.72%(n=4,P<0.01),并使钙通道电流-电压关系曲线下移(n=4,P<0.01)。表明PTD-BDNF与BDNF均可显著增强内向钠电流和钙电流。PTD-BDNF、BDNF使海马神经元钾通道电流IA、IK在20mv刺激处分别比对照组降低29.03%、28.06%和29.76%、33.38%,并使钾电流-电压关系曲线下移(n=4,P<0.01),表明PTD-BDNF与BDNF均可显著减弱外向钾电流。结论:PTD-BDNF融合蛋白显示了与脑源性神经营养因子相似的电压依赖性离子通道的调节作用,说明PTD-BDNF与脑源性神经营养因子在调节神经元静息膜电位、神经兴奋性方面有相同的分子基础。第三部分PTD-BDNF对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用目的:观察PTD-BDNF融合蛋白在动物体内实验中对脑缺血再灌注损伤的治疗效果,为进一步应用研究提供实验依据。方法:200~300gSD大鼠20只,随机分为PTD-BDNF组和生理盐水对照组,经颈内动脉插入0.26mm拴线,深度约18mm,建立大鼠大脑中动脉闭塞模型。PTD-BDNF组于手术后立即静脉注射PTD-BDNF融合蛋白0.5μmol·kg-1,此后每日注射一次,对照组同时注射等体积的生理盐水。再灌注48h,两组各取4只进行TTC染色;再灌注7d后,处死剩余大鼠,取脑进行HE染色及TUNNEL细胞调亡染色,分析PTD-BDNF融合蛋白对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。结果:在大鼠局灶性脑缺血再灌注模型中,与对照组相比,PTD-BDNF融合蛋白使脑缺血梗死体积百分比从18.20%降至10.12%(n=4,P<0.01)。HE染色可见PTD-BDNF处理后,脑组织缺血坏死程度明显减轻,细胞核皱缩、碎裂现象减少,正常神经元细胞存活较多。TUNNEL染色显示梗死灶周边平均每个视野TUNNEL阳性细胞率,从51.24%降至23.54%(n=6,P<0.01)。结论:PTD-BDNF融合蛋白经静脉给药后能通过血脑屏障发挥神经保护作用,减轻脑缺血再灌注损伤,改善神经功能。