牙鲆（Paralichthys olivaceus）是我国重要的海水养殖鱼类。牙鲆口感较好，营养价值丰富，受到消费者的喜爱，具有重要的经济价值。牙鲆养殖业在20世纪80年代得到了迅速发展。但是随着养殖密度的增大，牙鲆养殖环境不断恶化，病害频发，严重影响产量，同时也造成了抗生素滥用等现实问题。因此，急需培育出抗病性、抗逆性强的牙鲆新品种，满足目前牙鲆养殖业的迫切需要。为此，我们开展了以下工作:　　1.牙鲆鳗弧菌攻毒实验　　我们使用健康牙鲆混合群体进行攻毒实验，将牙鲆分为对照组和处理组，对照组腹腔注射生理盐水，处理组则将鳗弧菌配成109cfu/ml的菌悬液，用于牙鲆腹腔注射。将早期死亡的牙鲆视为鳗弧菌易感个体，在注菌实验中始终存活的个体为抗病个体。　　2.牙鲆丝氨酸蛋白酶Ⅰ-1(serine proteaseⅠ-1，SPⅠ-1)基因多态性的初步研究　　丝氨酸蛋白酶(serine protease)是一类蛋白水解酶，它是以丝氨酸为活性中心。丝氨酸蛋白酶在生物体中起到了极其关键而又广泛的生理作用，并且具有广泛的研究以及应用价值。本实验中我们利用重测序的方法，在牙鲆丝氨酸蛋白酶Ⅰ-1基因(PoSPⅠ-1)CDS中筛选出9个单核苷酸多态性位点(SNPs)。同时，我们扩增出PoSPⅠ-12605bp的启动子序列，从健康的牙鲆混合家系中选出部分样本，筛选出28个SNP位点。对感染鳗弧菌的抗病牙鲆个体和易感牙鲆个体进行了部分SNP位点的分型。通过分析CDS中SNP位点在抗病个体和易感个体的分布情况，发现SNP365A/G位点在抗病个体中的AG基因型的基因频率是60％，高于易感个体中的40％（P=0.01）。RT-qPCR结果显示，PoSPⅠ-1在抗病个体中的相对表达量高于易感个体的相对表达量，尤其在肾脏中的差异性表达极显著(p=0.0003)。以上结果表明，丝氨酸蛋白酶Ⅰ-1基因在牙鲆对抗鳗弧菌感染过程中发挥重要作用，该基因的SNP365A/G位点是与牙鲆鳗弧菌感染相关的候选位点，因此，该位点可能是牙鲆在抵抗鳗弧菌感染病害的选择育种方面潜在的标记。　　3.牙鲆c型溶菌酶基因(lysozyme)多态性的初步研究　　溶菌酶是在有机体中普遍存在的水解酶，它能够在先天性免疫中抵御细菌致病性感染，在先天性免疫中起到重要作用。在本实验中，我们在牙鲆溶菌酶基因(PolysC)的CDS中筛查出9个SNP。并且扩增出PolysC2077bp的启动子序列，筛查出2个插入-缺失位点和9个SNP位点。根据牙鲆对鳗弧菌的抗性筛选出抗性个体和易感个体，对CDS筛选出的SNP进行基因分型。通过分析PolysC CDS中SNP在易感个体和抗病个体的比例，发现其中的SNP140是一个重要的标记。SNP140是一个非同义突变，在抗病个体中140GC基因型在抗病个体中的比例为67.74％，高于易感个体的比例32.26％。PolysC在抗病个体中的肝、脾、肾、鳃的相对表达量分别要高于易感个体的相对表达量。这个结果可以在牙鲆抗病群体和易感群体中得到进一步证实。以上结果表明PolysC140G/C位点可以作为牙鲆选择育种的潜在标记。　　4.PoSPⅠ-1和PolysC启动子区域的克隆及测序　　PoSPⅠ-1和PolysC启动子区域的序列是通过本实验室的对牙鲆基因组测序的数据得到的。利用10尾牙鲆个体的cDNA进行PoSPⅠ-1和PolysC启动子区域的扩增。我们在测序结果中发现，在PoSPⅠ-1启动子区域共有28个SNP，在PolysC启动子区域共有2个插入缺失位点和9个SNP位点。根据测序结果找到上述两个基因在启动子区域的多态性位点，并用TFSEARCH来预测PoSPⅠ-1和PolysC上游调控区域的转录因子结合位点分析。