论文部分内容阅读
第一部分 rMS对体外神经干细胞增殖作用的研究 研究目的： 通过rMS对体外培养的神经干细胞(NSCs)进行不同参数的刺激，比较这几种参数下 rMS对 NSCs增殖的效应，确定最佳参数。并选用最佳参数刺激，检测 c-fos和p-CREB蛋白表达验证rMS对NSCs增殖作用机制。 研究方法： 取新生3天内的Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠双侧海马组织培养 NSCs，通过cck-8试剂盒检测第2代NSCs的OD值绘制生长曲线图。再将第2代NSCs分为3组，A组为最大输出强度25/50/100％，刺激频率为10Hz，脉冲数200/d；B组为A组的最佳强度，刺激频率为10Hz，脉冲数10/50/200/d；C组以最佳强度，最佳脉冲数，频率分别为1Hz/10Hz/20Hz，干预方法均为间隔24h1次，刺激3天。最后1次干预后1h收集细胞，通过CCK-8测定的OD值检测细胞增殖效应确定最佳频率，用Western Blot检测c-fos蛋白和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(p-CREB)的表达量，分析rMS对NSCs的增殖作用机制。数据均采用单因素ANOVA分析，多重比较选用LSD法分析。 结果： 1.第2代神经球生长曲线提示第3天活性最佳。 2.用 CCK-8测定 rMS各组参数的OD值，发现 NSCs在 A组参数下没有显著差异（p>0.05），选择50%最大输出强度进行B组刺激后也发现没有显著差异（p>0.05），选择每天刺激200次脉冲进行C组刺激后发现10Hz和20Hz与对照组差别有统计学意义(p=0.03，p=0.046)。 3.用50%最大输出强度，10Hz，每天200脉冲，刺激3天后western blot测定c-fos，p-CREB的蛋白表达量，结果显示rMS干预组比对照组有显著上升（p<0.01）。 结论： 1.10Hz、50%最大输出强度，200脉冲/天的rMS对NSCs的增殖作用最强。 2. rMS能促进体外NSCs的c-fos蛋白的表达和CREB蛋白的活化增加，可能是体外rMS刺激NSCs增殖的原因之一。 第二部分 mir-106b在rMS下对体外神经干细胞增殖机制的研究 研究目的：为了进一步探讨参数的脉冲刺激量与NSCs增殖的关系，本实验再次对体外培养NSCs进行不同脉冲数的rMS参数刺激，同时检测了NSCs的增殖率，以期观察量效关系。检测microRNA-106b家族成员的表达，以期解释NSCs在rMS下促增殖的机制。 研究方法：用10Hz，50%最大输出量(3.5T)，脉冲刺激量为每天200、400、600、800、1000脉冲干预体外NSCs，干预3天最后1次干预后1h收集细胞，测量以下相关指标：Ki67、EdU免疫荧光染色测定增殖细胞率；Western blotting检测 ki67、p21、cyclinD1、cyclinE、cyclinA、cdk2、cdk4蛋白表达量；qRT-PCR检测microRNA-106b、microRNA-93、microRNA-25表达量。rRT-PCR图像分析采用2-△△t均值方法。数据分析采用单因素ANOVA分析和多重比较选用sidark法。 研究结果： 1.ki67免疫荧光染色在 rMS800脉冲/d、1000脉冲/d与空白对照组比较有明显增高（p<0.01），1000脉冲/d组的阳性细胞率(20.65%）比空白组(9.25%）明显增加。ki67的蛋白表达量在600-1000脉冲/d与空白对照组比较有上升（p<0.01）。 2.EdU的阳性细胞率随刺激脉冲数增加而增加，由空白组的2.05%增加到1000脉冲组的4%，并在600脉冲/d与空白组比较有统计学意义（p=0.026），800、1000脉冲/d与空白组比较有明显增高（p=0.000）。 3. rMS对体外神经干细胞的刺激使mir-106b家族各成员表达趋势不同。与空白对照组比较，mir-106b和mir-93在600脉冲/d组有统计学差异（p=0.013，p=0.015），800、1000脉冲/d组为明显上升（p=0.000）。与空白对照组比较，mir-25在400、600、800、1000脉冲/d组下降有显著性差异（p<0.01）。 4. p21蛋白相对表达量随着脉冲刺激数目的增加而下降，与空白对照组比较，在800和1000脉冲/d组明显下降（p=0.001&p=0.000）。 5.cyclinD1、cyclinA、cyclinE、cdk2、cdk4蛋白含量均随脉冲刺激数增加而表达增加。cyclinD1在800、1000脉冲/d组有显著性上升（p=0.006,p=0.002）；cyclinA在600、800脉冲/d组表达上升（p=0.03，p=0.016），1000脉冲/d组表达明显上升(p=0.000)；cyclinE从200脉冲/d组开始上升（p=0.018），400脉冲/d组开始明显上升（p<0.01）；cdk2在400脉冲/d组上升（p=0.012），600-1000脉冲组明显上升(p<0.01)；cdk4在1000脉冲组/d与空白对照组相比差异有统计学意义（p=0.013）。 结论： 1.rMS能促进体外NSCs的增殖，增殖程度随着脉冲刺激量的增加而增加。 2.rMS促进体外NSCs增殖的机制与促进mir-106b/p21/cdks/cyclins通路相关。 第三部分过表达/抑制mir-106b在rMS下对神经干细胞增殖的影响 研究目的：分别通过慢病毒和Lipo2000转染神经干细胞促进/抑制mir-106b表达，研究 mir-106b对神经干细胞的作用，进一步证实 rMS对神经干细胞的增殖作用与mir-106b家族密切相关。 研究方法：分别通过慢病毒/Lipo2000转染siRNA神经干细胞，使其促进/抑制mir-106b表达。分为 sham+rMS组，空病毒/anti-mir106b阴性对照组，空病毒+rMS组/anti-mir106b阴性对照+rMS组，mir-106b过表达组/anti-mir106b组，mir-106b+rMS组/anti-mir106b+rMS组。干预参数为：10Hz，50%最大输出，每天1000脉冲，干预3天后进行 EdU荧光染色，western blot检测 p21，qRT-PCR检测 mir-106b。采用SPSS17.0统计软件包进行统计分析，方法采用单因素ANOVA分析和LSD法分析。 研究结果： 1.载体构建成功，慢病毒rLV-miR-106b滴度为：1.0x108 TU/ml。 2.EdU阳性细胞在mir-106b过表达组与空病毒组比较均有统计学意义，阳性细胞比例明显升高（p<0.01），mir-106b过表达+rMS组又较 mir-106b过表达组明显增高（p<0.01）。EdU阳性细胞在anti-mir106b+rMS组与anti-mir106b阴性对照组显著高于anti-mir106b组（p均为<0.01），anti-mir106b阴性对照+rMS组显著高于anti-mir106b阴性对照组（p<0.01）。 3.qRT-PCR的结果表明NSCs的mir106b表达量在mir106b过表达组与空病毒组+rMS组明显比空病毒组表达上升（p<0.01），并且 mir106b过表达+rMS组又比 mir106b过表达组明显升高（p<0.01）。发现在anti-mir106b+rMS组与anti-mir106b阴性对照组显著高于anti-mir106b组（p均为<0.01），anti-mir106b阴性对照+rMS组显著高于anti-mir106b阴性对照组（p<0.01）。 4.p21在mir-106b过表达组明显比空病毒组有显著下降（p<0.01），mir-106b过表达+rMS组明显较mir-106b过表达组下降（p<0.01），空病毒+rMS组较空病毒组明显下降（p<0.01）。p21在 anti-mir106b+rMS组和 anti-mir106b阴性对照+rMS组较anti-mir106b组降低（p<0.01），anti-mir106b阴性对照组显著低于 anti-mir106b组（p<0.01）。 结论： 1.mir-106b影响NSCs的增殖。 2.rMS的干预促进NSCs增殖的机制可能与促进了mir-106b，抑制p21的表达相关。