【摘 要】
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隐孢子虫病（cryptosporidiosis）是一种人畜共患寄生虫病,在全球范围内广泛传播和流行,它的病原包括顶复门下“隐孢子虫属”（Cryptosporidium）的所有物种。其中感染人体的主要为微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）和人隐孢子虫（Cryptosporidium hominis）两物种。隐孢子虫的感染是由卵囊传播的,受卵囊污染的水源和食品是最主要的传染途径
【基金项目】
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“十三.五”国家重点研发计划（2017YFC1601200）； 重要食源性寄生虫快速检测技术与装备研发（2017YFC1601206）；
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隐孢子虫病（cryptosporidiosis）是一种人畜共患寄生虫病,在全球范围内广泛传播和流行,它的病原包括顶复门下“隐孢子虫属”（Cryptosporidium）的所有物种。其中感染人体的主要为微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）和人隐孢子虫（Cryptosporidium hominis）两物种。隐孢子虫的感染是由卵囊传播的,受卵囊污染的水源和食品是最主要的传染途径。当前环境中隐孢子虫卵囊的检测方法（如PCR、IFA）不能区分死卵囊和活卵囊,但环境中只有活卵囊才真正具有感染风险,而卵囊失活后其形态和DNA可以存在数天至数周。由于卵囊死亡后,RNA快速降解（vsDNA仍可长时间存在）,所以检测卵囊RNA=检测活卵囊（或死亡不久的卵囊）,本研究以特异性检测只在C.parvum和C.hominis活卵囊中存在的RNA为策略,建立一种双探针qRT-PCR方法,用来敏感且特异的检测环境水源中对人体具有感染风险的具有活性的C.parvum和C.hominis卵囊。我们首先针对cgd6＿3920靶基因设计了双探针及特异性引物,该靶基因卵囊表达量高,可用于区分C.parvum、C.hominis、C.tyzzeri（作为对照）;接着优化了qRT-PCR的反应条件,包括引物和探针的浓度、反应的扩增程序,优化后本方法最低可检测到0.5个卵囊;对不同物种的隐孢子虫及其他相关原虫的样本进行检测,结果显示本方法对其他隐孢子虫物种以及其他病原无交叉反应,具有良好的特异性;我们还优化了一种通过反复冻融使卵囊失活的方法,通过对不同比例活卵囊的靶基因的DNA和RNA的定量,建立标准曲线,计算样品中活卵囊的百分比;此外,还建立了一种敏感的基于18S r RNA基因的q PCR方法,可作为对任何隐孢子虫物种的卵囊存在的检测;通过结合基于18S r RNA基因的q PCR和基于cgd6＿3920基因的qRT-PCR,我们检测了从中国吉林省长春市不同地区采集的280份水样。在这280个样品中,有20个样品检测出隐孢子虫,其中15个样品含有C.parvum的活卵囊。综上,我们建立并优化了一种双探针qRT-PCR方法,用于检测对人体有感染风险的隐孢子虫卵囊（parvum和C.hominis的活卵囊）,并利用环境水样对该方法进行了评估。该方法可适用于检测水体和其他样本中的活卵囊,如对于蔬菜和水果中C.parvum和C.hominis的活性卵囊的污染。
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