乳铁蛋白(lactoferrin,LF)是一种分子量为80kDa的糖蛋白,具有广泛的抗菌活性、显著的抗病毒能力,以及抗肿瘤、抗炎症、提高机体免疫等许多生物学功能,被广泛应用于医药、食品、化妆品乃至农业等诸多领域。然而,随着人们对乳铁蛋白产品的旺盛消费,传统的提取方法已难以满足日益增长的市场需求,故近年来研究人员开始探索利用转基因等技术表达重组乳铁蛋白,目前以酵母、昆虫细胞、水稻、牛、羊等作为生物反应器,成功表达出了转基因重组人乳铁蛋白。尽管上述探索为利用生物反应器生产重组人乳铁蛋白提供了有用借鉴和参考,但从酵母到哺乳动物细胞的基因工程表达系统存在细胞培养设备投资大、成本高和分离纯化复杂等缺点,而牛羊乳腺生物反应器尽管能大量生产具有与天然蛋白活性相近蛋白的优势,其研制时间长,前期投资大,并涉及许多技术领域,风险极高,许多问题还有待解决。因此,探索利用新型生物反应器生产重组人乳铁蛋白的研究已成为当前该领域研究的重点和热点之一。家蚕是迄今唯一被人类驯化和充分利用的昆虫种类,其最重要的价值就是分泌蚕丝。经过长达数千年的自然选择和人工驯化,家蚕的泌丝能力已有显著提高,一头蚕可分泌高达0.5g的丝蛋白,远超其他昆虫。不仅如此,家蚕还具有高等真核生物的蛋白质后修饰加工能力,以及大规模生产成本低、对人畜无毒害等优势,从而使其成为一种理想的新型生物反应器,有着巨大的开发潜力。近年来,包括本实验室在内,国内外已有少数研究机构在家蚕生物反应器开发方面进行了许多探索,并取得重大突破。在此基础上,本研究重点开展了利用家蚕丝腺生物反应器表达重组人乳铁蛋白的系统性研究。1人乳铁蛋白基因的克隆及转基因表达载体的构建提取人乳腺总RNA反转录获得cDNA,以其为模板进行PCR扩增获得人乳铁蛋白完整ORF片段,将该片段克隆至pMD19-T载体(命名为pMD19-LF),经测序验证目的片段正确。用限制性内切酶BamHI和NotI双酶切pMD19-LF载体,回收乳铁蛋白基因片段连接到经同样酶切处理的pSL[Ser1-DsRed-SV40]载体上,构建成pSL[ser1-rhLF-SV40];然后用AscI酶切pSL[Ser1-rhLF-SV40]载体,回收Ser1-rhLF-SV40片段并连接到经AscI酶切处理的pBac[3xp3-EGFPafm]载体,构建成pBac[3xp3-EGFP,Ser1-rhLF-SV40]。2转基因家蚕的获得提取pBac[3xp3-EGFP,Ser1-rhLF-SV40]质粒DNA,并与辅助质粒pHA4PIG按1:1摩尔比混合至终浓度为400ng/ul,注射到已解除滞育的蚕品种大造(P50)早期胚胎,共计注射蚕卵772粒,利用荧光显微镜对G1代进行筛选,得到9个阳性蛾圈,孵化后获得94头在眼睛和神经特异表达绿色荧光标记基因的转基因阳性个体。3核酸水平的分子生物学鉴定提取转基因蚕基因组DNA,分别进行PCR、Southern杂交和反向PCR检测,结果表明,rhLF已成功整合至家蚕基因组,并分别插入了家蚕第5号、6号和9号染色体上,其在家蚕基因组中至少有3种不同的插入形式。RT-PCR结果显示,由丝胶特异启动子Ser1启动的LF基因在家蚕中部丝腺高量转录表达。4重组人乳铁蛋白的蛋白水平检测取转基因蚕5龄7天丝腺组织,经PBS溶解、亲和层析及超滤,收集rhLF蛋白,分别以人乳铁蛋白标准本品和正常大造丝腺蛋白为对照,进行Western检测,实验结果表明,转基因蚕丝腺成功表达了重组人乳铁蛋白。分别选取大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为试验菌株,采用滤纸片法检测rhLF的抗菌活性。结果表明,rhLF蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均表现出与人乳铁蛋白标准品类似的抗菌作用,而对照组正常大造丝腺蛋白未表现出抗菌作用,初步证实本研究表达获得的LF重组蛋白具有生物活性,亦即具有抗菌活性。