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人β-防御素是近来年发现的具有广谱抗菌活性并在机体抵御外来微生物入侵中起防御作用的一类阳离子抗菌肽。 本论文研究了使用基因工程技术重组表达可溶性人β-防御素的方法。以人β-防御素-2(HBD-2)为示例蛋白,建立了从获得基因、载体构建,到表达体系选择、表达优化及放大,直至产物分离纯化、生物活性测定等整套工艺,并将其应用于HBD-3及HBD-4的重组表达。 从人体炎症皮肤组织(尖锐湿疣)中克隆获得了HBD-2的人源基因,并对密码子进行了分析及优化,合成了无宿主稀有密码子的基因。两基因的对比表达实验表明,合成基因的蛋白表达量约是人源基因表达量的9倍。 构建了多种HBD-2表达载体,分别在大肠杆菌、毕赤酵母菌及枯草芽孢杆菌3个表达系统中进行表达,经表达效果对比,选定了大肠杆菌系统的一个融合表达体系用于HBD-2的重组生产。 进行了大肠杆菌HBD-2融合表达体系的表达优化及放大工作。通过对摇瓶表达条件的研究,获得了如下的优化培养条件:培养基为MBL,培养温度为28℃,装液量为12%(v/v),在菌体对数生长中期添加IPTG至终浓度0.8mM进行诱导,诱导8hr后终止表达。目标蛋白的产量达到1.3g/l,其中92.3%以上是可溶性蛋白;通过对表达体系的进一步改造,实现了在37℃下表达可溶目标蛋白,缩短了培养周期并提高了目标蛋白的产率;在此基础上,将培养体系由摇瓶放大到10升发酵罐,可溶性成熟HBD-2产量约为235 mg/l。 进行了重组HBD-2的分离纯化及活性测定的研究。建立了成熟HBD-2总收率为29.2%,纯度为95.0%的分离工艺;所得重组蛋白经测定具有抑菌活性。 使用如上的表达策略成功地表达了重组HBD-3及HBD-4,所得产物占各自菌体总蛋白的33.6%及51.3%,可溶产物的比例分别为90.8%及89.1%。