小泛素相关修饰物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）是一类新发现的类泛素修饰物，广泛存在于真核生物中，是由多个成员组成的蛋白质家族。在哺乳动物中已经发现3种SUMO分子，分别为SUMO-1、SUMO-2及SUMO-3。SUMO修饰是一个动态的可逆过程，在一系列酶的催化下，SUMO与靶蛋白Lys侧链ε-NH2通过异肽键共价相连，从而介导不同的细胞内反应。SUMO特异性蛋白酶（sentrin-specific proteases，SENPs）在SUMO修饰过程中起了重要的调节作用。SENP是半胱氨酸蛋白酶超家族的成员之一，在真核生物体内主要功能是切除SUMO前体的C端，及介导去SUMO化使SUMO分子重新进入循环。至今已鉴定了7种哺乳动物的SUMO特异性蛋白酶（sentrin-specific proteases，SENPs）家族成员，称为SENP-1，-2，-3，-5，-6，-7，和-8，SENP每一个成员有不同的细胞定位和底物特异性。　　 荧光共振能量转移（fluorescence resonace energy transfer，FRET）技术因其对距离的极度敏感性，被广泛用于生物大分子结构、性质、反应机理以及定量分析等方面的研究。FRET以它稳定、无生物体毒性、不需任何外源反应底物及表达无种属和组织特异性的优点，成为检测蛋白——受体、蛋白——蛋白之间相互作用和相对空间位置的“分子尺”。　　 本研究的最终目的是检测不同SENP对于3种SUMO底物的底物特异性，测定酶活；构建可在体外应用荧光共振能量转移（FRET）技术检测SENP酶活性的ECFP-SUMO-EYFP生物检测系统。从而建立一种能用于临床的的SENP蛋白酶活性检测的体外FRET系统。　　 在大肠杆菌中诱导表达在供体增强型青色荧光蛋白（enhanced Cyan Fluorescent Poretin，ECFP）和受体增强型黄色荧光蛋白（enhanced Yellow Fluorescent Poretin，EYFP）之间以带有SENP特异性识别酶切位点的SUMO肽段连接的融合蛋白ECFP-SUMO1，2，3-EYFP；原核表达哺乳动物的SENP-1，-2，-3，-5 C端催化域及SENP-8全蛋白。融合蛋白ECFP-SUMO1，2，3-EYFP及SENP-1，-2，-3，-8可溶性表达在上清中。将以上蛋白进行Ni柱亲和层析。最终，融合蛋白ECFP-SUMO1，2，3-EYFP及SENP1C，2C，8可溶性表达在上清中并得到纯化，可用于后续实验的检测。　　 将纯化的融合蛋白依次用SENP2c及商品化的ULP1C切割，检测其底物特异性及相应酶活。利用SENP2c及ULP1C进行FRET现象的检测，结果表明，SENP2c及ULP1C均可有效抑制融合蛋白ECFP-SUMOs-EYFP的FRET现象，并表现出对时间和剂量的依赖关系。为活性SENP的检测提供了一种新途径。