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肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)是含有281个氨基酸残基的II型跨膜糖蛋白,属于肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)超家族成员。TRAIL 胞外段(114-281aa)可被蛋白酶剪切分泌至体液中,形成可溶性TRAIL(soluble TRAIL,sTRAIL)。sTRAIL在体内外能选择性杀死癌细胞而不损伤正常细胞,具有良好的临床开发与应用前景。建立快速、高效、经济的sTRAIL生产方式是基于sTRAIL发展新型抗肿瘤生物技术药物的关键问题。直接从生物细胞中提取sTRAIL的传统生产方式效率低下,而现代基因工程手段则能够更加高效地制备重组人sTRAIL(recombinant human soluble TRAIL,rhsTRAIL)。由于rhsTRAIL的抗肿瘤活性无需依赖糖基化的修饰过程,原核细胞被认为是最为适合的高效生产系统。然而,不溶性包涵体的大量形成不仅限制了 rhsTRAIL在工程化大肠杆菌中的经济生产,还直接影响到最终产品的应用安全性和有效性。改善rhsTRAIL在大肠杆菌(Escherichia.coli,Ecoli)中的可溶性表达水平、提高目标蛋白的生产效率,对于sTRAIL的基础研究以及进一步的开发应用均有重要的科学意义和实用价值。为此,本研究采用定点突变技术,通过对sTRAIL进行分子改造,尝试解决上述科学问题。主要研究工作如下:1.sTRAIL突变体的构建及其筛选首先,构建野生型sTRAIL的重组载体。本研究利用基因工程技术,在sTRAIL编码基因的5’-端上游添加了六聚组氨酸标签(His-Tag)和烟草蚀纹病毒特异性酶切位点(TEV)编码基因,通过两轮PCR制备了重组融合基因。用Nco Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切载体质粒pET28a,与纯化的融合基因片段连接构建了能够重组表达野生型sTRAIL的重组质粒pET28a/His-sTRAIL;随后,以野生型sTRAIL的重组质粒为模板,用定点突变技术构建四种位置型突变体的重组载体。分析不同位点对可溶性表达的相关性。从中筛选出B位点可以明显改善sTRAIL在E.coliBL21(DE3)中的可溶性表达。最后,在B位点上构建四种氨基酸类型突变体的重组载体,包括:包括酸性氨基酸(天冬氨酸,Asp)、中性含羟基氨基酸(丝氨酸,Ser)、中性氨基酸(甘氨酸,Gly)、中性含硫氨基酸(半胱氨酸,Cys)。通过可溶性表达和体外抗肿瘤活性的比较,筛选获得较野生型sTRAIL可溶性表达水平提高近5倍且抗肿瘤活性未受明显影响的sTRAIL有益突变体。2.sTRAIL突变体分子制备与性质鉴定其次,本研究利用蛋白质工程技术,将IPTG诱导表达、可溶性蛋白提取、硫酸铵分级沉淀、Ni-Sepharose亲和层析、TEV酶切加工和二次亲和层析等蛋白质纯化技术进行有机整合,建立了 msTRAIL的生产新工艺,并成功制得高纯度的目标蛋白;并采用 SDS-PAGE、BCA、Western-blot、Edman 降解以及圆二色谱(circular dichroism,CD)等方法技术对msTRAIL的相对分子量、含量、抗原性、N-端氨基酸组成以及蛋白质二级结构进行了系统鉴定。3.sTRAIL突变体的抗肿瘤活性鉴定最后,本研究利用细胞生物学技术,通过CCK-8检测、Annexin V/PI双染色以及Caspar活性测定等技术方法对新颖蛋白msTRAIL的肿瘤抑制活性、凋亡诱导效应和凋亡酶促发能力等进行了系统鉴定。证明了筛选制备的新颖sTRAIL具有与野生型蛋白相似的抗肿瘤生物学活性;与此同时,本研究还采用体内免疫实验对野生型和突变型sTRAIL的免疫原性进行了对比研究,证明了筛选获得的单一氨基酸定点突变并未显著改变sTRAIL的免疫特性,在一定程度保证了未来实际应用的安全性。综上所述,本研究通过用定点突变技术对sTRAIL进行分子改造,初步研究了N-末端氨基酸对其在大肠杆菌中可溶性表达的影响。并从中筛选得到可溶性表达水平显著提高到的原创分子,并据此建立了一条快速、高效、简便、经济的sTRAIL生产工艺;制备获得的目标蛋白生产效率较野生型sTRAIL有显著提高,每1L培养体系能够快速获得31.9mg纯度大于95%(SDS-PAGE)的目标蛋白;更为重要的是,本研究筛选获得的sTRAIL创新分子在保留了野生型sTRAIL的肿瘤抑制活性和凋亡诱导功能的同时并未明显增强免疫原性。这就为sTRAIL的基础研究和基于其进行的创新生物技术药物的研发奠定了基础。