研究背景量子点作为一种新型纳米生物材料,因其独特而优良的荧光特性、较小的尺寸以及表面可修饰性,正越来越多地被应用于生物和医学领域。然而,量子点的体内和体外暴露表现出多种细胞和组织器官毒性,成为其生物医学应用中面临的关键问题。肝脏是量子点体内暴露后最主要的分布和蓄积器官。虽然量子点的肝细胞和肝脏毒性已经被广泛报道,但其肝细胞和肝脏毒性效应的机制尚不清楚。NLRP3(NLR pyrin domain containing 3)炎症小体是近来发现的一种细胞内蛋白复合物,可被多种病原、大分子和环境刺激物激活。激活的NLRP3炎症小体使caspase-1活化,剪切IL-1β和IL-18成熟,并导致促炎性的细胞焦亡(pyroptosis)。异常激活的NLRP3炎症小体可引起肝脏的炎症反应、功能损伤和纤维化。本研究以NLRP3炎症小体为切入点,明确CdSe/ZnS量子点的肝细胞和肝脏毒性效应,揭示NLRP3炎症小体在其肝脏毒性中的作用,并通过线粒体活性氧(mt ROS)和Ca2+信号抑制,明确量子点激活肝细胞NRLP3炎症小体的分子机制。研究内容(1)在表征Cd Se/Zn S量子点理化特性的基础上,量子点暴露L02肝细胞,检测肝细胞对量子点的摄取,及其对肝细胞活力和LDH释放的影响,明确其肝细胞毒性影响。检测量子点暴露后肝细胞NLRP3炎症小体的激活和肝细胞焦亡,并采用siRNA技术对肝细胞NLRP3和ASC的表达进行沉默,明确NLRP3炎症小体在量子点所致的肝细胞焦亡中的作用。(2)10 n M/kg量子点尾静脉注射单次暴露C57 BL/6小鼠14天。暴露结束后检测肝脏组织病理形态,促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、CXCL1和MCP-1的表达以及中性粒细胞浸润标志物MPO水平,并检测血清ALT、AST、ALP和γGT水平,明确量子点的肝脏毒性。通过检测NLRP3炎症小体活化并应用NLRP3基因敲除小鼠,明确NLRP3炎症小体在量子点所致肝脏毒性中的作用。(3)应用ROS和mt ROS抑制剂NAC和Mito-TEMPO处理L02细胞和小鼠,检测NLRP3炎症小体激活、肝细胞焦亡、肝脏炎症反应和功能损伤,明确mtROS在量子点所致的NLRP3炎症小体活化、肝细胞焦亡,以及肝脏炎症反应和功能损伤中的作用。应用Ca2+抑制剂2-APB和BAPTA-AM与量子点共处理L02细胞,检测肝细胞mt ROS生成、NLRP3炎症小体激活和肝细胞焦亡,明确Ca2+动员在量子点所致肝细胞mt ROS生成、NLRP3炎症小体激活和焦亡中的作用。研究结果(1)本研究应用的Cd Se/Zn S量子点具有典型的量子点理化特征,可被L02细胞吞噬摄取。量子点暴露可剂量依赖性地引起肝细胞活力下降和LDH释放增加,表明具有明显的肝细胞毒性。量子点暴露激活了肝细胞NLRP3炎症小体并引起肝细胞发生焦亡,而si RNA干扰NLRP3和ASC,可减轻量子点导致的肝细胞焦亡和LDH释放,表明NLRP3炎症小体激活介导了量子点引起的肝细胞焦亡和肝细胞毒性。(2)量子点体内暴露引起了肝组织炎性焦点形成、促炎因子表达上调和中性粒细胞浸润为标志的炎症反应,并导致了肝脏功能的损伤。量子点暴露引起了肝脏NLRP3炎症小体的激活,而量子点在NLRP3基因敲除小鼠中引起的肝脏炎症反应和功能损伤显著轻于野生型,表明NLRP3炎症小体激活介导了量子点的肝脏损伤效应。(3)量子点暴露引起了肝细胞和肝脏ROS和mt ROS的生成,NAC和Mito-TEMPO显著抑制了量子点引起的肝细胞NLRP3炎症小体激活和肝细胞焦亡,并且抑制了量子点体内暴露导致的肝脏NLRP3炎症小体激活、炎症反应和功能损伤。量子点暴露导致肝细胞内Ca2+动员,2-APB和BAPTA-AM则显著抑制了量子点引起的肝细胞mt ROS生成、NLRP3炎症小体激活和肝细胞焦亡。研究结论量子点激活肝细胞NLRP3炎症小体并进一步引起肝细胞焦亡是其导致肝细胞毒性和肝脏损伤效应的机制之一。量子点通过激活NLRP3炎症小体引起肝细胞焦亡,进而导致肝脏炎症反应和功能损伤。量子点暴露引起的肝细胞内Ca2+动员启动了这一效应:量子点引起胞质Ca2+升高,导致mtROS生成增加,增加的Ca2+和mt ROS共同作用,使肝细胞NLRP3炎症小体激活,进而引起肝细胞焦亡、肝脏炎症和功能障碍。本研究揭示了量子点肝脏毒性的新机制,为解决量子点医学应用中的潜在毒性提供了依据。