我国是胃癌高发国家,胃癌发病和死亡例数分别占全球胃癌发病和死亡的42.6%和45.0%。中国肿瘤登记年报显示,2015年胃癌新发病例约为67.9万例,胃癌死亡病例约为49.8万例。而且,胃癌具有高度异质性,疗效差,易复发,预后差等特点,严重威胁人民健康。手术是根治早期胃癌的主要治疗手段,而传统化疗和放疗是进展期和复发转移性胃癌重要治疗手段。近年来,胃癌的精准治疗方兴未艾,以HER-2、VEGFR-2、PD-1/PD-L1为靶点的靶向治疗和免疫治疗实现了晚期胃癌治疗的突破,但胃癌整体人群的预后仍亟待改善。因此,深入研究胃癌发生发展的分子机制,探寻新的更为有效的治疗靶点和方法已成为研究的热点。miRNAs是一种长度约为21-25个核苷酸的单链非编码RNA,与靶基因的3′非编码区相互结合,可降解或抑制靶基因mRNA表达,发挥转录后调控作用。众多研究证实,miRNAs可调控大约30%mRNAs,具有强大的生物学功能。miRNAs失调与多种肿瘤存在因果关系,可作为抑癌基因或癌基因在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。近年来,miRNA模拟物和抑制剂在临床前研究中取得可喜的初步疗效。多种针对miRNA的靶向治疗已开展临床研究,显示出良好的发展前途。miRNA-33(miR-33)位于胆固醇调节元件结合蛋白(Sterol regulatory element-binding protein,SREBP)基因的内含子序列,包括a/b两个成员。既往研究显示,miR-33主要功能为协同其宿主基因调节胆固醇和脂肪酸的代谢。其功能相关靶基因主要包括ABCA1、ABCG1、NPC1、AMPK、Cpt1a、Crot和Sirt6等。最为经典的通路为miR-33靶向抑制ABCA1,从而导致胆固醇的输出降低,HDL的合成减少。近年来,文献报道miR-33可能在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥作用。多数研究认为,miR-33a的主要功能为抑癌基因,但也有报道认为miR-33a是一种癌基因。miR-33a在不同肿瘤中调控的信号通路不尽相同,而且在不同肿瘤发生发展过程中的作用各不相同。因此,miR-33a在恶性肿瘤中的作用和机制有待进一步深入研究。而且,对于miR-33在胃癌组织中的表达、功能和调控机制尚不清楚。本研究采用逆转录实时定量聚合酶链反应(Quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测了miR-33家族2个成员miR-33a/b在胃癌组织和配对癌旁非癌组织中的表达,并分析了miR-33a的表达水平与胃癌患者临床病理特征、肿瘤标记物以及预后的关系。采用qRT-PCR技术检测了1种正常胃粘膜上皮细胞株GES-1和SGC-7901、MKN-28、HGC-27、BGC-823胃癌细胞株中miR-33a的表达,并通过miRNA转染技术进行miR-33a的过表达或沉默,采用流式细胞技术、CCK-8(Cell-Counting Kit-8 assay)实验、划痕实验和Transwell实验研究了miR-33a对胃癌细胞株SGC-7901增殖、细胞周期和侵袭迁移等生物学功能的影响。通过生物信息学软件,预测miR-33a下游调控的靶序列;利用双荧光素酶报告基因分析检测miR-33a对其预测靶基因CDK-6、CCND-1、PIM1和P53的靶向作用;采用qRT-PCR和Western-blot检测转染miR-33a mimic和抑制剂后胃癌细胞株SGC-7901中预测靶基因CDK-6、CCND-1和PIM1表达变化,明确miR-33a对靶基因的调控作用;检测胃癌组织和其配对癌旁组织中CDK-6、CCND-1和PIM1的表达,验证miR-33a表达与预测靶基因之间的调控关系。主要研究内容和结果如下:第一部分miR-33a/b在胃癌组织中表达及其与临床病理特征及预后关系目的:检测miR-33家族在胃癌组织和配对癌旁组织中的表达情况,探讨miR-33家族表达与胃癌患者临床病理学特征及预后的关系。方法:采用qRT-PCR技术检测miR-200家族在胃癌组织和配对癌旁非癌组织中的表达差异。分析miR-33a表达差异及其与胃癌患者临床病理学特征、肿瘤标志物和胃癌患者术后无疾病生存期(DFS)的关系。结果:1.miRNA-33 a/b在胃癌组织和配对癌旁组织中的表达。57例胃癌患者术后组织标本和配对癌旁组织中,miR-33a和miR-33b表达的下调率分别是75.44%(43/57)和56.14%(32/57)。胃癌组织中miR-33a表达(Median:0.04516;Interquartile Range:0.74817)显著低于配对癌旁组织中的miR-33a表达(Median:0.07197;Interquartile Range:1.39304,P<0.001)。而胃癌组织中miR-33b的表达(Median:0.00372;Interquartile Range:0.00521)与癌旁组织表达(Median:0.00371;Interquartile Range:0.00681)无显著差异(P=0.113)。2.胃癌组织miR-33a表达与胃癌患者临床病理学特征的关系。在57例胃癌患者中,miR-33a表达与肿瘤分化程度、肿瘤TNM分期、T分期及M分期存在显著相关性(P=0.000,P=0.002,P=0.005和P=0.000),与患者的性别、年龄、N分期和脉管瘤栓情况无显著相关性(P=0.211,P=0.127,P=0.113,P=0.643)。采用多元线性回归分析,发现肿瘤分化程度(Beta=-0.391;t=-3.164;P=0.003)、肿瘤M分期(Beta=-0.325;t=-2.016;P=0.049)与miR-33a的表达存在显著负相关;而miR-33a表达与肿瘤T分期(Beta=-0.029;t=-0.169;P=0.867)、N分期(Beta=0.265;t=1.745;P=0.087)和脉管瘤栓(Beta=0.038;t=0.297;P=0.768)无显著相关性。3.miR-33a表达与胃癌患者肿瘤标志物的关系。miR-33a表达与胃癌患者外周血中CA-199水平呈负相关(r=-0.407,P=0.002),但与胃癌患者外周血中CEA、CA-50、CA-724水平无显著相关性(r=0.067,P=0.632;r=-0.214,P=0.132;r=-0.100,P=0.477)。4.miR-33a表达与胃癌术后患者DFS的关系。在57例胃癌患者有4例患者失访,6例Ⅳ期患者,剔除以上10例患者后,共有47例患者进行术后DFS分析。所有患者的中位DFS为13.6月(6.0月-28.9月)。miR-33a高表达胃癌术后患者的DFS显著高于miR-33a低表达患者[中位DFS(95%CI):16.6月(8.5月-24.7月)vs.9.8月(4.6月-15.0月),P=0.04]。小结:1.miR-33a表达在胃癌组织中显著低于配对癌旁组织,而miR-33b表达在胃癌组织和癌旁组织之间无显著差异,提示miR-33a可能在胃癌发生发展过程中发挥作用。2.miR-33a表达与胃癌患者的肿瘤组织分化程度、远处转移及外周血中CA-199的水平显著负相关,提示miR-33a可能参与胃癌细胞分化、增殖和转移调控机制。3.胃癌组织miR-33a表达水平与胃癌术后患者的DFS显著相关。与miR-33a低表达患者相比较,miR-33a高表达患者的DFS显著延长。提示miR-33a可能成为胃癌患者潜在的预后影响因子。第二部分miR-33a对胃癌细胞生物学功能的影响及其调控机制目的:观察胃癌细胞株与正常胃粘膜上皮细胞中miR-33a表达的差异;明确miR-33a在胃癌细胞株SGC-7901增殖、侵袭和迁移等生物学行为中的作用和机制。方法:采用qRT-PCR技术检测了1种正常胃粘膜上皮细胞株GES-1和SGC-7901、MKN-28、HGC-27、BGC-823胃癌细胞株中miR-33a的表达差异;将miR-33a模拟物和抑制剂转染入胃癌细胞株SGC-7901实现miR-33a沉默或过表达,应用流式细胞技术、CCK-8实验、划痕实验和Transwell实验研究观察miR-33a表达变化对胃癌细胞株SGC-7901细胞周期、细胞增殖和侵袭迁移能力的影响。结果:1.miR-33a在4种胃癌细胞株及正常胃上皮细胞中的表达(Mean±SD)与正常胃粘膜上皮细胞株GES-1中的表达(1.00±0.112)相比较,miR-33a在胃癌细胞株MKN-28(0.341±0.031,P=0.000)、SGC-7901(0.581±0.042,P=0.000)、BGC-823(0.538±0.029,P=0.000)和HGC-27(0.701±0.049,P=0.002)中表达显著降低。该结果与胃癌组织与癌旁组织之间的表达差异一致。2.人胃癌细胞株SGC-7901转染miR-33a mimic和Inhibitor后miR-33a的表达变化本研究采用SGC-7901细胞设计体外细胞模型,利用qRT-PCR法检测miR-33a mimic转染组、mi R-33a Inhibitor转染组和AllStars Negative Control siRNA转染组(阴性对照组)和未处理组(空白对照组)48h后miR-33a的表达状况,结果显示:阴性对照组与空白对照组中miR-33a的表达没有显著差异(0.96±0.005 vs.1±0.020,P=0.859);miR-33a mimic转染组胃癌SGC-7901细胞中miR-33a的表达水平较空白对照组显著提高(434.83±9.58vs.1±0.020,P<0.001)。miR-33a Inhibitor转染组胃癌SGC-7901细胞中miR-33a的表达水平较空白对照组显著下降(0.36±0.03 vs.1±0.020,P<0.001)。提示转染实验成功,可进行后续实验研究。3.miR-33a表达对人胃癌细胞株SGC-7901细胞增殖能力的影响CCK-8细胞增殖检测显示,SGC-7901细胞转染48小时后,miR-33a mimic转染组、miR-33a Inhibitor转染组、空白对照组、AllStars Negative Control siRNA转染组(阴性对照组)的OD值(Mean±SD)分别为0.549±0.03、1.54±0.12、1±0.09、0.953±0.06。与空白对照组相比,miR-33a mimic转染组的SGC-7901细胞增殖显著降低(P<0.001),miR-33a Inhibitor转染组的SGC-7901细胞增殖显著增强(P<0.001)。4.miR-33a表达对人胃癌细胞株SGC-7901细胞增殖周期的影响流式细胞仪检测结果显示,SGC-7901胃癌细胞转染48小时后,miR-33a mimics转染组的G0/G1期、S期和G2/M期的比例(Mean±SD)分别为68.30±0.85%、23.94±0.46%和7.76±0.89%;而miR-33a Inhibitor转染组三期的比例分别为56.30±0.95%、39.43±0.55%和4.27±0.74%;阴性对照组三期的比例分别为60.94±0.88%、35.74±0.75%和3.32±0.56%。两组之间比较G0/G1期和S期均存在显著差异(P<0.05)。转染miR-33a的SGC-7901胃癌细胞在G1期停滞,提示miR-33在调控G1/S期转换中起重要作用。5.miR-33a表达对人胃癌细胞株SGC-7901侵袭迁移能力的影响划痕实验结果显示,miR-33a mimic转染组、miR-33a Inhibitor转染组和AllStars Negative Control siRNA转染组的划痕愈合比例(Mean±SD)分别为103.41±6.21%、95.376±6.55%和100.00±10.06%。与阴性对照组比较,miR-33a mimic和Inhibitor转染组均无显著统计学差异(P=0.253,P=0.146)。Transwell实验结果显示,miR-33a mimic转染组、miR-33a Inhibitor转染组、All Stars Negative Control siRNA转染组24小时后每个视野下穿过细胞数(Mean±SD)为87±4.9、83±7.2、76±5.3。与阴性对照组比较,miR-33a mimic转染组和miR-33a Inhibitor转染组24小时后每个视野下穿过细胞数均无显著性统计学差异(P=0.341,P=0.663)。小结:1.miR-33a在胃癌细胞株中的表达显著低于正常胃粘膜上皮细胞,与胃癌组织与癌旁组织之间的表达差异一致。2.miR-33a具有抑制SGC-7901胃癌细胞增殖的作用。3.miR-33a转染SGC-7901胃癌细胞在G1期停滞,提示miR-33a在调控G1/S期转换中起重要作用。4.miR-33a调控对SGC-7901胃癌细胞的侵袭迁移能力无显著影响。第三部分miR-33a对预测靶基因PIM1/CCND1/CDK6/P53的调控机制目的:研究miR-33a对预测靶基因PIM1/CCND1/CDK6/P53的调控作用,明确miR-33a在胃癌细胞增殖功能中调控通路和机制。方法:运用MicroRNA生物信息学网站和软件,结合miR-33a对胃癌细胞增殖功能的影响,预测和筛选可能的作用靶序列。通过双荧光素酶报告基因分析的方法检测miR-33a对其预测靶基因靶向作用;采用qRT-PCR和Western-blot检测转染miR-33a mimic和Inhibitor的胃癌细胞株SGC-7901中预测靶基因CDK6、CCND和PIM1的表达变化;并通过检测胃癌组织和配对癌旁组织中靶基因的表达,进一步验证miR-33a与靶基因表达的关系。结果:1.生物信息学预测Hsa-miR-33a的目标靶基因。通过在线生物信息学网站FindTar 3.0数据库,同时结合miRBase,miRanda,PicTar等数据库的检索结果,本研究推测筛选出CCND1、CDK6、PIM1和P53作为miR-33a调控细胞增殖的潜在预测靶基因。2.双荧光素酶报告系统对miR-33a预测靶基因CCND1、CDK6、PIM1和P53的验证。双荧光素酶报告基因分析显示,与AllStars Negative Control siRNA转染组(阴性对照组)相比较,miR-33a mimics转染组可显著降低PIM1(0.78±0.03 vs.0.97±0.33,P<0.05)、CCND1(0.56±0.01 vs.0.98±0.05,P<0.01)和CDK6的相对荧光强度(0.45±0.01 vs.1.05±0.03,P<0.01),而P53的相对荧光强度无明显变化(0.87±0.06 vs.1.04±0.03,P=0.138)。提示在胃癌细胞中PIM1、CCND1、CDK6基因是miR-33a靶基因,而P53并不是miR-33a的靶基因。3.调控胃癌细胞SGC-7901中miR-33a表达对靶基因CCND1、CDK6和PIM1表达的影响。miR-33a mimic转染SGC-7901胃癌细胞后,CDK6、CCND1和PIM1的mRNA表达水平较阴性对照组均显著降低(0.18±0.01 vs.1.10±0.03,P<0.01;0.21±0.02 vs.0.94±0.09,P<0.01;0.43±0.09 vs.0.95±0.08,P<0.01);反之,转染miR-33a抑制物的SGC-7901胃癌细胞的CDK6、CCND1和PIM1的mRNA的表达水平较阴性对照组均显著升高(3.24±0.17 vs.1.10±0.03,P<0.01;1.97±0.14 vs.0.94±0.09,P<0.01;2.13±0.11 vs.0.95±0.08,P<0.01)。同样,miR-33a mimic转染SGC-7901胃癌细胞后,CDK6、CCND1和PIM1的蛋白表达水平较阴性对照组均显著降低;而转染miR-33a抑制物的SGC-7901胃癌细胞的CDK6、CCND1和PIM1的蛋白表达水平较阴性对照组均显著升高。4.CDK6、CCND1、PIM1和P53在胃癌组织中表达及其与miR-33a表达的相关性。与癌旁组织相比较,49.1%(28/57),54.4%(31/57),68.4%(39/57)和68.4%(39/57)的胃癌组织中存在CDK6、CCND1、PIM1和P53 mRNA表达的上调。胃癌组织中PIM和P53的mRNA表达水平显著高于癌旁组织(P=0.004;P=0.039);而CDK6和CCND1的mRNA表达水平无显著统计学差异(P=0.429;P=0.467)。mi R-33a表达与CDK6、CCND1和PIM1的表达呈显著负相关(r=-0.282,P=0.033;r=-0.353,P=0.010;r=-0.323,P=0.014);与P53表达无显著相关性(r=-0.095,P=0.482)。小结:1.CDK6、CCND1和PIM1是胃癌中miR-33a调控的靶基因。2.miR-33a可通过靶向抑制CDK6、CCND1和PIM1的表达,调控细胞周期,抑制胃癌细胞增殖。结论:1.miR-33a在胃癌组织中表达较癌旁组织显著下降;miR-33b在胃癌组织中表达与癌旁组织无显著差异;miR-33a表达与胃癌患者的肿瘤组织分化程度、远处转移及外周血中CA-199的水平呈显著负相关;与miR-33a低表达患者相比较,miR-33高表达胃癌术后患者的DFS显著延长。2.miR-33a在胃癌细胞株中的表达显著低于正常胃粘膜上皮细胞;miR-33a具有抑制胃癌细胞增殖的作用;miR-33a可调控SGC-7901胃癌细胞增殖周期,将细胞周期阻滞于G1期,从而抑制胃癌细胞增殖;miR-33a表达变化对SGC-7901胃癌细胞的侵袭迁移能力无显著影响。3.CDK6、CCND1和PIM1是miR-33a的靶基因;miR-33a可通过抑制CDK6、CCND1和PIM1的表达,调控细胞周期,抑制胃癌细胞增殖。