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结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,在40至50岁年龄段中发病率很高。美国每年约有150000名结肠癌患者。由于饮食的变化,目前我国结肠癌的发病率逐年增高,结肠癌已成为我国恶性肿瘤死亡的第四大原因,每年约有140000例确诊病例。手术治疗、化学治疗、放射治疗和靶向治疗依然是结肠癌的主要治疗手段,患者术后5年生存率约50%。众多研究证实,结肠癌的高复发率是导致患者预后不良的主要因素之一。因此,寻找能够抑制结肠癌转移的药物至关重要。近年来,中草药以其价格低廉、耐受性强以及副作用较小的特点受到众多医生和患者的认可和青睐。南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb)属于卫矛科植物,有祛风湿、活经络、解毒镇痛的功效。本课题组前期研究发现,南蛇藤乙酸乙酯提取物(Celastrus orbiculatus extracts,COE)可以抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移;经过药物敏感试验筛选,发现南蛇藤提取物对于消化系统肿瘤的抑制作用较为明显,本课题组之前的工作已证实南蛇藤总萜可以抑制结直肠癌细胞的增殖。南蛇藤提取物的相关提取工艺与应用已获国家发明专利授权(专利号为:ZL200710025343.3)。DJ-1基因(RS/PARK7/CAPI)位于人1号染色体断臂的远端(1p36.12-1P36.33),其mRNA含有567个编码子,编码189个氨基酸残基。它是分子质量约20kDa的保守蛋白。DJ-1作为氧化还原的伴侣和传感器,可保护细胞免受许多人类疾病(如癌症)中氧化应激诱导细胞凋亡的影响。DJ-1在肿瘤中的异常表达在多种癌症中均被报道证实,但是在结肠癌中研究较少。本课题组前期研究的结论证实DJ-1在结肠癌中扮演癌基因的角色,且具有相应的生物学功能;另外,南蛇藤提取物作用于结肠癌细胞后通过蛋白质组学筛选,发现DJ-1蛋白是南蛇藤提取物作用于结肠癌细胞的靶标之一,这使其成为临床癌症治疗中具有吸引力的治疗靶标。本论文主要研究COE能否调控DJ-1抑制结肠癌的迁移与侵袭。通过实验研究,初步阐述了 COE调控DJ-1对结肠癌迁移与侵袭的影响,并探讨了 DJ-I在结肠癌里的作用及机制。通过体内外实验结果发现,COE能够通过调控DJ-1抑制肠癌的迁移和侵袭。第一部分构建DJ-1高表达、DJ-1低表达及各自对照组的人结肠癌HCT 116稳定表达细胞株目的:构建稳定高表达和低表达DJ-1的人结肠癌HCT 116细胞株。方法:含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养人结肠癌HCT 116细胞至对数期,将DJ-1高表达(LV-DJ-1)、DJ-1高表达对照组(LV-DJ-1-ctrl)、DJ-1低表达(LV-DJ-1-RNAi)、DJ-1 低表达对照组(LV-DJ-1-RNAi-ctrl)感染人结肠癌HCT 116细胞。24小时后,倒置荧光显微镜下观察细胞形态变化以及荧光表达情况。用含2ug/ml嘌呤霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640培养基对感染LV-DJ-1、LV-DJ-1-ctrl、LV-DJ-1-RNAi和LV-DJ-1-RNAi-ctrl的HCT 116细胞进行筛选,直到获得稳定表达的HCT 116/LV-DJ-1、HCT 116/LV-DJ-1-ctrl、HCT 1 16/LV-DJ-I-RNAi 及 HCT 1 16/LV-DJ-1-RNAi-ctrl细胞,然后利用Western blot实验方法检测HCT 116细胞中DJ-1蛋白的相对表达情况。结果:LV-DJ-1、LV-DJ-1-ctrl、LV-DJ-1-RNAi、LV-DJ-1-RNAi-ctrl 慢病毒感染24h后,倒置荧光显微镜下可见细胞贴壁良好,呈梭形,细胞边缘清晰,核质均匀,绿色荧光明显,占细胞90%左右,感染效率较高。Western blot实验检测结果显示,与HCT 116/LV-DJ-1-ctrl相比,HCT 116/LV-DJ-1细胞内DJ-1蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与 HCT 116/LV-DJ-1-RNAi-ctrl相比,HCT 116/LV-DJ-1-RNAi细胞内 DJ-1 蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:稳定表达的HCT 116/LV-DJ-1和HCT 116/LV-DJ-I-RNAi人结肠癌细胞株构建成功。第二部分DJ-1能够促进人结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭,是预测结肠癌患者预后的独立分子标志物目的:证实DJ-1在结肠癌中具有促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭,能够有效预测结肠癌患者的预后,是潜在的治疗靶点。方法:用RT-PCR和Western blot分别检测人结肠上皮细胞FHC和7种人肠癌细胞(SW 620、DLD-1、RKO、HCT 116、SW480、HT 29和 HCT 15)中DJ-1 的 mRNA和蛋白表达水平。同时Western blot实验检测8对新鲜人肠癌组织及对应的癌旁组织中DJ-1的表达水平。免疫组化检测470例人结肠癌标本中DJ-1的表达水平,并进行统计分析其表达水平与临床病理特征的相关性。Cox单因素和多因素分析DJ-1与人结肠癌患者预后的相关性。MTT、细胞划痕、流式细胞术、Transwell、Edu等实验揭示DJ-1在人肠癌HCT 116细胞增殖、迁移与侵袭过程中扮演的角色。Western blot研究DJ-1对PI3K/AktmTOR、PI3K/Akt/p27 cylin E 以及 NF-κB/Snail 信号通路的调控。选取稳定表达HCT 116/LV-DJ-1、HCT 116/LV-DJ-1-RNAi及各自对照组细胞。用0.9%生理盐水分别悬浮浓度至1×107/ml,各取200uL接种于裸鼠右侧皮下及腹腔,构建皮下移植瘤和腹腔转移瘤动物模型。将裸鼠随机分为4组,每组6只,分别为HCT 116/LV-DJ-1组、HCT 116/LV-DJ-1-ctrl组、HCT 116/LV-DJ-1-RNAi组及HCT 1 16/LV-DJ-1-RNAi-ctrl组。每三日测量裸鼠肿瘤的长短径,计算出肿瘤体积。每两日测量裸鼠的体重,28天之后采取颈椎脱臼的方法对所有裸鼠进行处死,分离出裸鼠皮下移植瘤和腹腔肠系膜上的肿瘤结块并称重,拍照记录,同时使用免疫组化方法检测实体瘤中相关蛋白表达:DJ-1、p-P13K、p-Akt、p27、cylin E、p-mTOR、NF-κB、Snail、N-cadherin、E-cadherin和 Vimentin。结果:DJ-1表达在结肠癌细胞或组织中均高表达。Kaplan-Meier生存曲线显示DJ-1高表达的结肠癌患者总生存期比低表达患者明显较差。Cox多因素回归分析的结果表明,DJ-1是预测结肠癌预后的独立标志物。通过MTT、细胞划痕、流式细胞术、Transwell、Edu和裸鼠模型等实验证明了 DJ-1能够促进人结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。另外,Western blot 证实了DJ-1 可以调控PI3K/Akt/p27/cyclin E或PI3K/Akt/mTOR信号通路,从而抑制结肠癌细胞的转移。与此同时,证实了NF-κB/Snail信号通路是在DJ-1的调控下,诱导结肠癌细胞EMT促进迁移和侵袭。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示DJ-1低表达结肠癌患者与单独手术者相比,术后采取奥沙利铂+5-氟尿嘧啶+四氢叶酸(LFP)方案治疗可延长总生存期,DJ-1可以作为有前途的结肠癌预后标志物并预测患者的化疗疗效。结论:DJ-1能够促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并且可以预测结直肠患者的预后。第三部分COE通过DJ-1抑制人结肠癌细胞的增殖、迁移与侵袭的作用研究目的:研究COE通过调控DJ-1对人结肠癌细胞增殖、迁移与侵袭的影响。方法:南蛇藤茎研磨打碎,乙醇热回流提取三次,加水分散后石油醚和乙酸乙酯萃取三次得到COE。用含10%血清的RPMI-1640培养基配置浓度为1600ug/ml溶液后,再用0.22um的微孔滤膜过滤器过滤即可使用。体外培养人结肠癌HCT 116和HCT 116/LV-DJ-1-RNAi细胞,设置COE浓度(0,50,100,200,400ug/mg)。通过MTT检测COE对人肠癌HCT 116细胞的增殖影响并计算出IC50。用1/2 IC50分别作用于HCT 1 16和HCT 116/LV-DJ-1-RNAi,观察COE对HCT 116和HCT 116/LV-DJ-1-RNAi增殖抑制的影响。运用细胞划痕实验和Transwell观察COE对HCT 116和HCT 1 16/LV-DJ-1-RNAi的迁移和侵袭的影响。结果:MTT结果显示不同浓度的COE(0,50,100,200,400ug/mg)对于HCT 116细胞具有明显的增殖抑制作用,并呈现出时间和浓度的依赖性,计算出48h的IC50值约等于140ug/ml。为了排除药物毒性对实验的影响,我们用1/2 IC50值浓度作用于HCT 116和HCT 116/LV-DJ-1-RNAi 12,24,36,48h后,与HCT 116(阴性对照组)相比,加药组细胞增殖能力明显降低;与HCT 116/LV-DJ-1-RNAi(阴性对照组)相比,加药组细胞增殖能力无明显变化。细胞划痕愈合和Transwell实验结果表明,与各自对照组相比,70ug/ml浓度的 COE 作用于HCT 116和HCT 116/LV-DJ-1-RNAi48h后,HCT 116组细胞迁移和侵袭的能力均明显降低,而HCT 116/LV-DJ-1-RNAi组无明显变化。结论:COE可以调控DJ-1抑制人结肠癌细胞的增殖、迁移与侵袭。