前言　　阿尔茨海默病(Alzheimersdisease，AD)是最常见的痴呆形式，是病因未明的原发性退行性脑变性疾病，多起病于老年前期或老年期，潜隐起病，缓慢进展，以智能损害为主。AD的神经病理学特征是出现皮层弥漫性脑萎缩，神经元大量减少，可见到淀粉样沉积物或老年斑(senileplaque，SP)和神经元缠结（neurofibrillarytangles，NFTs）等。AD发病的确切原因仍然不清楚，包括基因异质学说、胆碱能系统功能障碍学说、钙代谢紊乱学说、铅中毒学说、自由基损伤学说、神经营养因子信号转导障碍学说、β-淀粉样蛋白（β-amyloidpeptide，Aβ）毒性学说和Wnt信号通路减弱学说等等。发生AD时，病人脑内的胆碱能神经系统发生障碍，尤其是基底前脑的皮层和海马区域的胆碱能神经元变性更为明显。胆碱能神经元的功能障碍与Aβ的神经毒性密切相关。乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AchE)可促进Aβ的形成，在老年斑中AchE与Aβ形成Aβ-AchE复合物，其毒性大于Aβ。Wnt(Wingless-typemousemammarytumorvirusintegrationsitefamilymember)信号途径在细胞粘附、细胞分化等方面起重要作用，并参与胚胎发育、细胞生长调节、轴突形成和大脑、海马的发育等过程。现在研究发现Wnt信号通路的改变与神经变性疾病的发病密切相关。尤其是两个关键因子:糖原合酶激酶3β(glycogensynthasekinase-3β，GSK-3β)和β-连环蛋白(β-catenin)发生改变。临床使用的乙酰胆碱受体激活剂和乙酰胆碱酯酶抑制剂均可通过激活Wnt信号通路缓解AD胆碱能神经元的功能障碍，用于AD的治疗。环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMPresponseelementblingprotein，CREB)是细胞内的一个重要信号分子，调节多种基因的表达，在神经元的生长、分化、存活和突触可塑性的形成等过程中发挥重要作用，与学习记忆过程中的长时程记忆有关。近年的研究还发现，CREB参与神经变性过程，而Wnt信号通路上的GSK3β蛋白对CREB蛋白的活性有抑制作用，这也说明Wnt信号通路可以参与CREB蛋白的调节。　　神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)是神经营养因子家族中最早被发现的、具有神经元营养和促进突起生长的、具有双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用，对中枢胆碱能神经元有保护和修复作用。尤其是基底前脑的胆碱能神经元对NGF具有高反应性，NGF可恢复因胆碱能神经元损伤所引起的认知功能障碍，同时胆碱能神经元的激活能使自身免受AD病变的进一步侵害。文献报道，NGF通过鼻腔给药，可以通过鼻腔嗅区将NGF吸收进入脑脊液，绕过血脑屏障，进入中枢神经系统，发挥神经保护作用，为NGF进入脑内靶区提供了有效的途径。　　本研究采用APP/PS1转基因小鼠，经鼻腔给予NGF，旨在观察NGF能否通过影响胆碱能神经元来影响AD的学习记忆功能，影响APP的代谢过程;NGF能否通过调控胆碱能神经元来调节Wnt信号通路的关键蛋白，影响Wnt信号通路，进而影响AD的进程;NGF能否通过直接调节CREB蛋白或者通过调节Wnt信号通路来调节CREB蛋白，进而发挥神经保护作用，为AD治疗的新途径提供理论依据。　　实验方法　　采用双转染人APP695swe基因和人早老素1（presenilin，PS1）dE9突变基因(APPswe/PS1dE9，APP/PS1)的5个月AD模型小鼠为研究对象，经鼻腔给予NGF治疗14w，应用Morris水迷宫实验检测APP/PS1转基因小鼠的学习记忆能力变化;应用免疫组织化学技术检测APP/PS1转基因小鼠脑组织内老年斑的分布;应用ELISA技术对APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ1-40和Aβ1-42的含量进行分析;应用Westernblot技术检测APP/PS1转基因小鼠脑内APP蛋白及APP代谢相关蛋白水解酶ADAM10、BACE1和PS1的表达、Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白GSK-3β、p-GSK-3β和β-catenin、p-β-catenin蛋白的表达以及CREB蛋白、p-CREB蛋白的表达。　　实验结果　　1、外源性NGF对APP/PS1转基因小鼠学习和记忆能力的影响　　Morris水迷宫实验结果显示:在定位航行实验中，AD+NGF组APP/PS1转基因小鼠的潜伏期和找到平台前所经过的总路程均显著低于AD组小鼠，但均未达到野生组小鼠水平;在空间探索实验中，AD+NGF组APP/PS1转基因小鼠经过目标平台位置的次数明显高于AD组小鼠，游泳总路程和平均游泳速度均明显低于AD组小鼠，但均未达到野生组小鼠水平。整个实验结果表明外源性NGF改善APP/PS1转基因小鼠的学习和记忆能力。　　2、外源性NGF对APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ老年斑的影响　　免疫组织化学染色结果显示:AD+NGF组和AD组APP/PS1转基因小鼠的大脑皮层及海马等区域均有Aβ老年斑的阳性表达。AD组小鼠脑内的老年斑数量多，体积大;AD+NGF组小鼠脑内的老年斑数量少，体积小。　　图像分析定量结果显示:与AD组小鼠相比，AD+NGF组小鼠大脑皮层和海马内Aβ老年斑的数量分别减少了30.22％和47.41％，Aβ老年斑的沉积分别减少了35.85％和52.13％。　　3、外源性NGF对APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ1-40和Aβ1-42含量的影响　　ELISA结果显示:与AD组相比，AD+NGF组小鼠脑内的Aβ1-40和Aβ1-42含量均减少，分别减少了20.27％和27.35％，但均未达到野生组小鼠水平。　　4、外源性NGF对APP/PS1转基因小鼠脑内APP代谢的影响　　Westernblot结果显示:外源性NGF增加APP/PS1转基因小鼠脑内APP蛋白的表达，增加ADAM10蛋白的表达，减少BACE1蛋白和PS1蛋白的表达。　　5、外源性NGF对APP/PS1转基因小鼠脑内Wnt/β-catenin信号通路的影响　　Westernblot结果显示:外源性NGF减少APP/PS1转基因小鼠脑内GSK3β蛋白的表达，增加p-GSK3β蛋白的表达;增加β-catenin蛋白的表达，减少p-β-catenin蛋白的表达。　　6、外源性NGF对APP/PS1转基因小鼠脑内CREB蛋白的影响　　Westernblot结果显示:外源性NGF增加APP/PS1转基因小鼠脑内CREB蛋白和p-CREB蛋白的表达。　　结论　　1、外源性NGF改善APP/PS1转基因小鼠的空间学习和记忆能力。　　2、外源性NGF促进APP/PS1转基因小鼠脑内APP蛋白向非淀粉样途径代谢，减少脑内Aβ的生成，减少Aβ老年斑的数量和沉积。　　3、外源性NGF可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路对APP/PS1转基因小鼠神经元起保护作用。　　4、外源性NGF可能通过增加CREB和p-CREB蛋白的活性，改善APP/PS1转基因小鼠的学习记忆能力，对神经元起保护作用