论文部分内容阅读
研究背景:胃癌是世界上最常见的严重危害生命健康的恶性肿瘤之一,在我国其发病率居各类肿瘤的首位。临床上治疗胃癌的药物主要为化疗药物,但现在胃癌的化疗面临低缓解率高毒性的困境。研究开发新的预防及治疗的途径,成为克服这个世纪疾病重要的策略发展方向。
近30年来的流行病学及基础研究表明,炎症作为一种促癌因素在肿瘤的发生发展过程中起到重要的作用,而相关研究显示非甾体抗炎药(NSAIDs)包括低毒副作用的环氧酶2(cyclooxygenase2,COX-2)选择性抑制剂在预防和治疗消化道肿瘤中显示出了巨大的潜力。COX是花生四烯酸代谢合成前列腺素(prostaglandin)的限速酶。在哺乳动物中至少有两种同工酶,即COX-1和COX-2。COX-1在大部分正常组织中组成性表达并维持正常的生理功能,而COX-2在大部分组织中不表达或低表达,可被炎症因子、生长因子、肿瘤促进因子等诱导表达。目前已发现多种类型的肿瘤包括胃痛过表达COX-2。因此,COX-2成为了抗肿瘤研究的一个重要的潜在活性靶点。
目前研究表明:NSAIDs通过抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡、阻止肿瘤血管的形成等多种机制起到抑制肿瘤生长的作用。除了发挥直接的抗肿瘤活性外,NSAIDs还具有放疗增敏作用。此外,NSAIDs还可以减轻化疗药物引起的静脉炎,粘膜炎以及腹泻。然而,NSAIDs与当前的一线抗肿瘤药物联合应用后,能否增加疗效,减少不良反应的发生,目前还不明确。
本研究组已发现COX-2选择性抑制剂celecoxib能够拮抗顺铂在人食管鳞癌细胞中的抗肿瘤活性。进一步的机理研究显示celecoxb通过抑制顺铂进入细胞从而减少细胞内顺铂的蓄积以及Pt—DNA加合物的形成,最终拮抗顺铂的抗肿瘤活性。并且,celecoxib的这一作用与它抑制COX-2的活性无关。体内实验也显示虽然celecoxib和顺铂单独用药都显示了抗肿瘤活性,但是联合用药后并未增强药物的抗肿瘤活性。这就提示我们,抑制食管鳞癌细胞的COX-2活性具有一定的抗肿瘤效果,而COX-2抑制剂和抗肿瘤药物联合使用后则很可能通过非COX-2依赖的途径对抗肿瘤药物的活性产生影响。
基于上述研究,本课题在另外一种COX-2高表达的消化道恶性肿瘤胃癌上研究COX-2抑制剂celecoxib(塞来昔布)、SC-236、nimesulide(尼美舒利)和非选择性抑制剂indomenthacin(吲哚美辛)与顺铂联合应用后对人胃癌细胞的抗肿瘤活性,并进一步阐明相关可能的作用机制。
目的:研究COX抑制剂(celecoxib、SC-236、nimesulide及indomethacin)与顺铂合用后对人胃癌细胞的抗肿瘤活性,探讨COX抑制剂影响顺铂细胞毒作用的机制。并且,通过建立裸鼠胃癌移植瘤模型进一步研究COX抑制剂对顺铂体内抗肿瘤活性的影响。
方法
1.MTT法检测COX抑制剂对顺铂发挥细胞毒作用的影响COX抑制剂(celecoxib、SC-236、indomethacin和nimesulide)联合顺铂或顺铂单独处理胃癌细胞MKN45、TMK1和AGS,然后MTT法检测细胞活力。
2.COX抑制剂对顺铂引起的细胞凋亡的影响(1)检测DNA片段化:药物浓度为20μM的celecoxib和SC-236单独或与顺铂(0、10、20μM)联合处理细胞,琼脂糖电泳分析COX-2抑制剂拮抗顺铂诱导的细胞凋亡作用。
(2)Western blotting检测PARP的剪切:30μM顺铂单独或联合20μM COX抑制剂(celecoxib、SC-236、indomethacin和nimesulide)处理胃癌细胞MKN45,作用24 h后提取蛋白,测定蛋白含量,然后取等量蛋白进行聚丙酰胺蛋白电泳(SDS-PAGE),检测PARP剪切。
3.COX抑制剂对细胞内顺铂的蓄积,顺铂与DNA的结合,细胞摄入顺铂以及细胞运出顺铂的影响
(1)COX抑制剂对细胞内顺铂蓄积的影响:30μM顺铂单独或联合20μM的COX抑制剂(celecoxib、SC-236、indomethacin和nimesulide)处理胃癌细胞MKN45,作用2 h后收集细胞,裂解细胞,电感耦合等离子体质谱(ICP—MS)检测细胞内顺铂含量。
(2)COX抑制剂对Pt-DNA加合物形成的影响:30μM顺铂单独或联合20μM的COX抑制剂(celecoxib、SC-236、indomethacin和nimesulide)处理胃癌细胞MKN45,作用2 h后收集细胞,Wizard SV Genomic DNA Purlfication System试剂盒提取细胞DNA,ICP-MS检测Pt—DNA加合物的形成。
(3)COX抑制剂对细胞摄入顺铂的影响:30μM顺铂单独或联合20μM的COX抑制剂(celecoxib、SC-236、indomethacin和nimesulide)处理胃癌细胞MKN45,作用5 min后收集细胞,裂解细胞,ICP-MS检测细胞内顺铂含量。
(4)COX抑制剂对细胞运出顺铂的影响:30μM顺铂处理MKN45细胞2 h后,PBS充分洗涤细胞,然后加入不含顺铂的培养基或COX抑制剂继续培养2 h。收集并裂解细胞,ICP-MS检测细胞内顺铂含量。
4.裸鼠移植瘤模型研究celecoxib对顺铂体内抗肿瘤活性的影响4到6周的雌性队LB/c nu/nu裸鼠用于实验研究。将MNK45细胞悬液接种到裸鼠的右背部皮下,每只裸鼠接种2×106个细胞。然后每两天用游标卡尺测量一次肿瘤的大小。肿瘤的大小按照以下公式计算:V(体积)=L×W2/2,其中L是肿瘤纵轴的长度,W是肿瘤横轴的长度。接种后10天,所有老鼠都长出明显肿瘤。将裸鼠随机分为4组,按以下方案给药:(1)对照组；(2)顺铂给药组,每周给药一次,每次腹腔注射2 mg/Kg,共4周；(3)celecoxib给药组,每天给药一次,灌胃给药100 mg/Kg,共4周；(4)顺铂和celecoxib联合用药组,两种药均按照上两组给药方式。给药结束后,处死裸鼠并取出肿瘤组织,根据肿瘤大小,评价celecoxib对顺铂体内抗肿瘤活性影响。
5.统计学分析数据分析和作图依据均是由GraphPad Prism4.03(数据分析和作图软件),所有数据采用SPSS13.0软件包进行统计分析处理。
结果:
1.COX-2选择性抑制剂celecoxib和SC-236拮抗了顺铂对人胃癌细胞(MKN45、TMK1和AGS)的细胞毒作用,而非选择性COX抑制剂indomethacin和另一个COX-2选择性抑制剂nimesulide对顺铂的细胞毒作用没有影响。
2.琼脂糖电泳分析显示:celecoxib和SC-236能够显著减弱顺铂引起的DNA片段化；Western blotting结果显示:celecoxib与SC-236抑制了顺铂引起的PARP剪切,而nimesulide和indomethacin不影响顺铂引起的PARP剪切。
3.ICP-MS结果显示celecoxib和SC-236降低了顺铂在肿瘤细胞内的积蓄,并减少了Pt—DNA加合物的形成。进一步的研究发现,celecoxib和SC-236通过减少顺铂的摄入以及增加顺铂的运出来减少顺铂在细胞内的蓄积。
4.裸鼠移植瘤实验显示,顺铂、celecoxib单独以及两药合用均能够明显减少肿瘤的大小；然而,联合用药的抗肿瘤活性并不强于单独用药。
结论:COX-2选择性抑制剂celecoxib以非COX-2依赖途径拮抗顺铂在胃癌细胞的细胞毒性作用。相关研究结果表明:COX-2选择性抑制剂celecoxib和SC-236拮抗了顺铂的细胞毒作用,而另一个COX-2选择性抑制剂nimesulide和非选择性抑制剂indomethacin并不影响顺铂的细胞毒作用。这一结果提示celecoxib通过非COX-2依赖的途径拮抗顺铂的细胞毒作用。进一步的研究发现celecoxib通过减少顺铂的摄入和增加顺铂的运出,引起细胞内顺铂蓄积的减少以及Pt—DNA加合物形成的减少。此外,裸鼠胃癌移植瘤实验也显示,celecoxib和顺铂合用后,并不能增强顺铂的抗肿瘤活性。综上所述,尽管celecoxib和顺铂单独都能抑制肿瘤的生长,但是由于celecoxib减少顺铂在细胞内的蓄积从而拮抗了顺铂的细胞毒作用,我们的研究结果不推荐celecoxib和顺铂联合用于胃癌的治疗。